Способ получения токсоплазменного антигена

(51) М. Кл А 61 В 10/00 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий(71) Заявители Ж. К. Омаров, А, А. Боровиков и В. М. Красов Научно-исследовательский ветеринарный институт и институт зоологии АН Казахской ССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСОПЛАЗМЕННОГО АНТИГЕНА Изобретение относится к области иммунохимии, в частности к способам получения биологических диагностических препаратов, аименно - антигена для серологической диагностики токсоплазмоза.Известны способы получения антигенов длядиагностики токсоплазмоза из инвазионногоматериала путем экстракции его эфиром испирт-эфирно-фенольной смесью.Однако этот способ трудоемок и длителен,при этом антиген, получаемый по известномуспособу, не дает четких положительных серологических реакций с сыворотками кровиспонтанно или экспериментально зараженныхтоксоплазмой сельскохозяйственных и дикихживотных.Наиболее близким по технической сущностии достигаемому эффекту к предлагаемомуизобретению является способ, включающийизвлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию клеток токсоплазм ультразвуком и выделение из полученного ультразвукового лизатаантигенной фракции изоионным фракционированием,Однако этот способ также оказался неприемлемым для получения антигена из токсоплазм, так как получаемые антигенные препараты проявляют в серологических реакцияхнедостаточно выраженную специфичность: они дают положительные результаты не только с гомологичными токсоплазменными сыворотками крови, но и с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат здоровых 5 белых мышей, что указывает на наличие вантигенах балластных веществ, снижающих их активность и специфичность.Цель изобретения состоит в разработкеэкспресс-способа получения стандартного одо нородного антигена с высокоактивными и специфическими свойствами, пригодного для использования в нескольких иммунологических реакциях: в реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации 15 (РНГА) и реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РП-гель) для серологической диагностики токсоплазмоза.Постановленная цель достигается тем, чтов известном способе, включающем извлечение 20 и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцшо токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием, ультразвуковую дезинтеграцшо 25 клеток токсоплазм проводят 2 - 3-х кратно сотделением лизата оболочек токсоплазм н выделением из него антигенной фракции изоионным фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с по- ЗО следующей очисткой антигенной фракции отнеспецифических балластных веществ добавлением к ней антисыворотки.Способ получения антигена заключается в следующем.Для проведения способа необходимы следующие реактивы и растворы: натрий хлористый (х, ч,), едкий натр (х, ч.), серная или соляная кислота (х, ч.), 0,25, 0,5 и 1 н. растворы едкого натра, 0,25, 0,5 и 1 н. растворы серной или соляной кислоты 0,85%-ный раствор хлористого натрия (физиологический раствор),Получение исходного сырья.Материалом для получения токсоплазменного антигена служит перитонеальный экссудат белых мышей, зараженных эталонным штаммом токсоплазм или одним из вирулентных штаммов, выделенным от сельскохозяйственных животных. Для этого белых мышей весом 16 - 18 г партиями по 200 - 250 голов заражают перитонеальным экссудатом от исходных штаммных токсоплазменных мышей. Экссудат для заражения разводят стерильным физиологическим раствором так, чтобы в поле зрения микроскопа (увеличение 15 М 40) были видны 1 - 3 токсоплазмы. Доза заражения мышей - 0,2 мл, На 4 - 5 день после заражения мышей наркотизируют эфиром и стерильным шприцом из брюшной полости извлекают перитонеальный экссудат. Брюшную полость каждой мыши дополнительно промывают 0,5 мл физиологического раствора. Собранный материал проверяют на наличие токсоплазм и отсутствие посторонней микрофлоры путем микроскопирования мазков, После проверки экссудат центрифугируют в стерильных пробирках в течение 30 - 45 мин при 3 - 4 тыс, об/мин, Надосадочную жидкость удаляют. Осадок содержит токсоплазмы и примесь лейкоцитов и гистиоцитов перитонеального экссудата мышей. Чтобы избавиться от этих клеточных балластных компонентов осадок ресуспензируют в 5 - 10 мл физиологического раствора и затем многократно пропускают через тонкую иглу шприца для разрушения клеточных элементов экссудата, К полученной взвеси добавляют 10 - 15 мл физиологического раствора, снова пропускают через иглу шприца и после этого центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин в течение 45 - 60 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а обработку осадка повторяют еще 2 - 3 раза, после чего отмытый осадок токсоплазм пригоден для приготовления антигена.Градуированная дезинтеграция т о к с о п л а з м. Дезинтеграцию осуществляют в поле ультразвуковых волн низкочастотного диспергатора (УЗДН) градуированно в три приема: первые две обработки проводят в физиологическом растворе, последнюю - основную - в дистиллированной воде.В стеклянный сосуд с водяным охлаждением вносят 1 - 2 г отмытых токсоплазм, заливают 50 - 100 мл физиологического раствора и создают в контактной среде ультразву 60 65 15 - 20-минутным центрифугированием при 8 - 10 тыс. об/мин.Надосадочную жидкость (лизат 1 Ч) снова прогревают ультразвуком до оптимальной температуры 35 - 40 С, медленной нейтрализацией 0,5 - 1,0 и, раствором серной кислоты 4ковые колебания частотой 22 - 35 кгц и акустической мощностью 20 - 50 вт/см в течение 5 - 10 мин. Взвесь частично разрушенных токсоплазм центрифугируют при 8 - 10 тыс.об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат 1) сливают, а к осадку добавляют 50 в 1 мл физиологического раствора и обработку токсоплазм повторяют также при частоте 22 - 35 кгц, но мощности 50 - 75 вт/см и уже в течение 30 - 40 мин, Взвесь разрушенных токсоплазм центрифугируют при 8 - 10 тыс, об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат 11), представляющую собой солерастворимую протоплазматическую часть токсоплазм, отделяют от осадка оболочек ток соплазм, который промывают в дистиллированной воде 2 - 3-х кратным центрифугированием при вышеуказанном режиме. Отмытый осадок ресуспензируют в 20 - 30 мл дистиллированной воды, среду усредняют 0,25 - 0,5 н, раствором едкой щелочи в пределах рН 8,0 - 8,2, переносят в сосуд для озвучивания и обрабатывают ультразвуком частотой 22 - 35 кгц, мощностью 40 - 60 вт/см 5 - 10 мин.Небольшое количество нерастворившегося осадка отделяют от жидкой части центрифугированием.Полученная надосадочная жидкость - водный раствор оболочек токсоплазм (лизат ЗО 111) - является материалом для полученияспецифического токсоплазменного антигена.Ультразвуковое изоионное фокусирование и выделение специфической анти генной фр акции. ФракЗ 5 ционирование ультразвукового лизата 111 начинают с фокусирования балластных фракций, которые могут содержаться в лизате при недостаточно полной предварительной очистке токсоплазм и недостаточно тщательном граду ированном разделении токсоплазм ультразвуком на лизат 111 и неспецифические протоплазматические лизаты 1 и 11. Для этого лизат 111 переносят в химический стакан на 50 в 1 мл и подвергают 2 - 3-минутному воз действию ультразвуковой частотой 22 - 35 кгци мощностью 50 - 75 вт/см (без применения охлаждающей системы), что приводит к быстрому прогреванию обрабатываемой среды до оптимальной для последующего фракцио нирования температуры 35 - 40 С. Электрометрическим титрованием с помощью рН-метра и 0,5 - 1,0 н, раствора едкого натра лизат 111 подщелачивают до рН 10,5 - 11,5, в пределах которых фокусируется в виде мел ких хлопьев небольшое количество осадка -антигенная фракция А. Для полноты осаждения стакан с лизатом 111 дополнительно выдерживают в термостате при 37 С 20 - 30 мин. Сформировавшийся осадок отделяют5 1 О 5доводят рН среды до 9,0 - 9,5 и фокусируют антигенную фракцию В,. Лизат 1 Ъ выдерживают в термостате 20 - 30 мин, а затем центрифугируют. Из надосадочной жидкости (лизат Ъ) аналогичным образом при рН 6,8 - 7,2 осаждают третий осадок - антигенную фракцию С и получают основной, очищенный лизат И, из которого ультразвуковым изоиш.ым фракционированием выделяют при рН 3,5 - 5,5 специфическую антигенную фракцию Р:. П"сле центрифугирования специфическую фракцию Р с помошью ультразвука растворяют в 20 - 30 мл дистиллированной воды при рН 8,0 - 8,2 и проводят последующую ее очистку.Иммунохимическая очистка специфической антигеной фракции Р проводится с помощью антисыворотки на нативный перитонеальный экссудат белых мышей (на балластные вещества). Ее получают путем иммунизации кроликов нативным перитонеальным экссудатом здоровых белых мышей, Мышам интраперитонеально вводят по 0,2 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Через 30 мин насыщенный раствор вводят повторно в дозе 0,4 - 0,5 мл. По истечении одного часа от момента первого введения насыщенного раствора мышей наркотизируют, вскрывают и затем из брюшной полости извлекают шприцем экссудат. Собранный материал центрифугируют при 3 тыс. об,Ъин в течение 30 мин. Полученный материал вводят 4 раза кроликам в возрастающих дозах с интервалом в 2 - 3 недели между первой и второй инъекциями и в одну неделю между последующими (1 цикл иммунизации). При первой инъекции материал вводят в смеси с дополнителем Фрейнда под кожу боковой поверхности туловища кролика, Остальные 2 - 3 инъекции материала производят внутримышечно без дополннтеля Фрейнда, Реиммунизацию (11 цикл иммунизации) проводят через 30 - 40 дней с момента последнего введения материала. Она состоит из одной или двух инъекций материала без дополнителя в мышцу бедра с интервалом 4 - 5 дней между введениями. На 7, 14 и 21 ди после последнего введения материала у животных берут кровь и проверяют титр сыворотки в РСК или РП в агаровом геле.Полный цикл иммунизации 4 - 5 месяцев, после чего антисыворотка готова для очистки специфической фракции Р,Специфическую антигенную фракцию Р проверяют на чистоту преципитацией с анти- сывороткой на нативный перитонеальный экссудат белых мышей (на балластные вещества). К пробиркам с прогрессивно уменьшающимся количеством антигенной фракции (0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мл) добавляют по 0,5 мл цельной или разведенной (в зависимости от титра) антисыворотки на балластные вещества. Смесь в пробирках тщательно перемешивают и инкубируют при 37 С в течение 1,5 - 2 час, а затем помещают на 18 - 24 час в холодильник при 4 С. Контролями служат 15 2 О 25 зо 35 40 45 50 ( оо 6антисыворотка и антигенная фракция с физиологическим раствором. Реакция на балласт считается положительной, если в одной или нескольких пробирках отмечается преципитат(осадок) . Если преципитат отсутствует во всех пробирках (отрицательная реакция), то антигенную фракцию сразу же используют в качестве специфического токсоплазменного антигена. В случае положительной реакции (наличия преципитата) по пробирке с максимальным количеством преципитата высчитывают необходимое количество антисыворотки для осаждения балласта и добавляют ее ко всему объему антигенной фракции. Смесь также инкубируют 1,5 - 2 час в термостате и выдерживают 18 - 24 час в холодильнике. Образовавшийся преципитат отделяют центрифугпрованием в течение 20 - 30 мин при 8 - 10 тыс. об/мин. Из надосадочной жидкости ультразвуковым нзоионным фокусированием при рН 3,5 - 5,5 выделяют очищенную специфическую антпгенную фракцшо.Приготовление и стандартизация токсопл азменно антигена. Осадок очищенной от балласта антигенной фракции Р промывают в дистиллированной воде 2 - 3-х кр атны м ультразвуковым р астворением при рН 0,8 - 8 Я и переосаждением при рН 3,5 - 5,5, Отмытый осадок растворяют в 20 - 30 .;:л дистиллированной воды при рН 8,0 - 8,2. Этот раствор антигенной фракции является специфическим токсоплазменным антигеном.Стандартизацшо антигена проводят по серологической активности титрацией с гиперимунными токсоплазменнымп сыворотками, Оптимальный рабочий титр антигена в РСК и РНГА 1: 20 - 1:160, а для РП в агаровом геле - исходное разведение. Чувствительность токсоплазменного антигена по обнаружению специфических токсоплазменных антител в сыворотке крови гипериммунных, экспериментально зараженных и спонтанно больных животных характеризуется в РСК в разведении сыворотки 1:5 1:640 и в РНГА - 1:40 - 1: 2560, а в РП в агаровом геле - одной линией преципитации.Для стабилизации антиген лиофилизируют в рабочем титре с защитной средой. В высушенном виде, в ампулах, он представляет собой мелкопористую таблетку белого цвета, легко растворяющуюся в дистиллированной воде и физиологическом растворе, Срок годности лиофилизированного антигена 2 - 3 года,Приготовленный по описанному способу токсоплазмсниый антиген испытан комнссионго, апрсбпрован и ВГНКИ и в широком производственном опыте и показал высокую специфичнссть прп серологической диагностике токсоплазмоза. Формула изобретенияСпособ получения токсоплазменного анти- гена для серологической диагностики, вклюРедактор Е, Дайч Корректор Л, Котова Заказ 2364/1 Изд. Хо 1735 Тираж 630 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рашская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 чающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфической активности антигена, ультразвуковую дезинтеграцию клеток токсоплазм проводят 2 в 3 кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изоионным фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с последующей очисткой антигенной фракции от неспецифических балластных ве ществ добавлением к ней антисыворотки.