Способ получения мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу оболоченного антигена “фракции 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19,801 А 12 И ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТй .11 ЕЛЬСТВУ руироваентов "мыетения яве эффекполучения танто ивност у которых стабиль бность к продукц чумного микробаотсутствует спос"фракции 1" прикака. Цель дости хранении Тох -приз+ется за счет отбоче ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ АВТОРСКОМУ СВИ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ЧУМНОГО МИКРОБА, ДЕФЕКТНЫХ ПО СИНТЕЗУОБОЛОЧЕЧНОГО АНТИГЕНА "ФРАКЦИИ 1"(57) Изобретение относится к областибактериальной генетики, а именно кобласти мутагенеза плазмид (П), Донастоящего времени не существует простого и надежного способа полученияГга 1 Тох+ штаммов (Ш) чумного микроба, необходимых для конс ния,высокоактивных Ш-проду шиного"токсина. Целью изоб ляется упрощение и повьппен клонов с делецией генов, определяюх продукцию Рга 1 на рУТ-плазмнде У.рез 11 з 377, после посева клеток ого Ш, содержащего П рУР: : Тп, наосалатный агар при 37 С. Способ приняется в генетических исследованиях У. резЫз для исследования роли а 1 в биологии этого микроорганизи упрощают получение моноспецифиских диагностических сывороток к. пниному" токсину чумного микроба.Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к области мутаФгенеза плазмид.Целью изобретения является упроще 5 ние и повышение эффективности способа,Упрощение и повышение эффективности способа достигается за счет высева клеток У.рея 1 хя 377 рУТ, рУЧ, рУРТп) на пластинку питательного 1 О ,агара, бедного по содержанию свободными двухвалентными катионами, с последующим исследованием выросших при 37 С клоков.Способ осуществляется следующим 5 образом.Готовят1 млрд взвесь 18-часовой культуры У .резня 377 рУТ, рУ 7, рУРТп) в физрастворе и 10 клеток высевают на пластинку 1,57-ного 20 агара В (или Хоттингера) с 15-25 мМ оксалата Иа, рН 7,0-7,2. Посевы инкубируют 2-3 сут при 37 С.В этих условиях на поверхности агара вырастают 200-400 круцных коло ний(3 мм в диаметре) на Фоне газона мелких (с 1 мм) клонов. Клет 1 ки из крупных колоний после 2-кратной чистки на агаре с оксалатом Иаопри 37 С проверяют на способность к ,продукции "фракции 1" в реакции непрямой гемагглютинации РНГА) с коммерческим антительным диагностику мом и выделяют из них плазмиднуюДНК.Достаточно исследовать 6-8 клонов, поскольку 90-957, крупных колоний не продуцируют "Фракцию 1" в результате делеции ДНК рУТ-плазмиды размером 15-20 Мй. Продукцию токсина проверяют в реакции преципитации с анти токсической сывороткой. Она, как правило, сохраняется. Полученные делеционные варианты плазмид могут быть переданы в клетки авирулентных вакционных штаммов для конструирования"безопасных" штаммов-продуцентов с помощью известных способов при мобилизации конъюгативными Р-плазмидами,П р и м е р 1. 10 клеток У.рея 1 я 377 (рУТ, рУРТп 1) высевают на поверхность агара ЬВ, содержащего5 М оксалата. Иа, рН 7,0 и инкубируют посевы гри 37 С. Через 2 сутовырастают 200-400 колоний размером 3 мм. Бактерии из шести проверенныхни 55 колоний не продуцируют Фракцию 1 пои 11 данным РНГА, продукция мышиного токсина по данным преципитации в теле с антитоксической сывороткой у них сохраняется. Выделения и гель-электроФорез у плазмидной ДНК обнаруживают делецию плазмид рУТ. Реверсии к Рга 1 -фенотипу не наблюдают в течениео года при хранении штаммов при +4 С.П р и м е р 2. 10 клеток У,рея 5+1 я 377 (рУТ, рУРТп 10) высевают на пластинку 1,57-ного агара 1 В с 20 мМ оксалата Еа, рН 7,2. Посевы инкубируют при 37 С 3 сут. Частота появления крупных колоний -1 О . 10 таких клонов исследуют на продукцию "Фракции 1", "мышиного" токсина и проводят гель-электрофорез выделенной из них плазмидной ДНК. В восьми из них имеется делеция рУТ-плаэмиды с потерей "фракции ", но с сохраненной продукцией мышиного токсина.П р и м е р 3. 10 клеток штамма У.резня 377 (рУТТп, рУ 7, рУРТп 10) высевают на агар, содержащий 25 мм оксалата Иа, рН 7,1, прио37 С. Через 2 сут отбирают для анализа 10 крупных колоний (частота их-ьпоявления -10 ), В девяти из них отсутствует Рта 1 и имеет место делеция рУТТп 7 при сохранении Тох - признака.Оптимальной концентрацией оксалата Иа, добавляемого в питательный агар, является 20 мМ. Однако использование 15-25 мМ оксалата Иа также дает хоро-. шие результаты. Концентрация выше 25 мМ ингибирует рост клеток, а при дозе ниже 15 мМ - Рга 1 -клоны мало отличаются по размером от Рга 1 -вариантов, что затрудняет отбор мутантов. рН 7,0-7,2 используемой среды является обычной для выращивания клеток чумного микроба, Время инкубации . посевов 2-3 сут. Ранее 2 сут . колонии слишком мелкие, более 2 сут инкубировать не рекомендуется, так как Рга 1 -клоны увеличиваются в размерах, приближаясь по величине к Рга 1 -вариантам, что может затруднить отбор мутантов. Предлагаемый способ позволяет получить Тох Рга -варианты штамма У. рея 1 я 377, отсутствие оболочечного антигена у которых обусловлено потерей генов, детерминирующих его продукцию в результате делеции плазмиды рУТ. Причина, обуславливающая такие делеции при росте используемого штамма на оксалатном агаре, пока не выявлена. Возможно это результатформула изобретения Составитель НКузенкова Техред М.ДидыкРедактор Н. Гунько Корректор,М. Шароши Заказ 6041/25 Тираж 520ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 314391 индукции 1 Б-рекомбинации в условиях дефицита Са и Мд . Полученный делеционный вариант плазмиды рУТ из У. рез 1 хз 377 легко передать путем транс 5 дукции илимобилизации конъюгативной В-плазмидой в другие штаммы чумного микроба. При этом в силу несовместимости гомологичных репликонов происходит утрата резидентной рУТ-плазмиды и полученные штаммы приобретают стойкий ТохфРга -фенотип.Предлагаемый способ является простым, поскольку для получения искомых мутантов достаточно однократного 15 посева клеток У.рез 1 з 377 на агар с оксалатом Иа, в то время как известный способ требует многократных пересевов на средах с дефицитной сывороткой к "фракции 1", Значительно повышается эффективность способа.Если в известных способах удается получать единичные мутанты, не продуцирующие оболочечный антиген, которые к тому же часто реверсируют к 25 224дикому фенотипу, предлагаемый спосбб обеспечивает выход сотен клонов со стабильным Рга 1 -фенотипом: вследствие делеции соответствующих генов. Кроме того, способ не требует использования дорогих реактивов и занимает мало времени. Способ получения мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу оболочечного антигена "фракции 1" путем посева взвеси на питательную среду,оинкубирования при 37 С и исследования выросших клонов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения выхода мутантов, взвесь клеток штамма Уегвпа ревСв 377, содержащего наряду с плазмидами рУТ, рУЧ плазмиду рУРТп, детерминирующую пестиционогенность, высевают на оксалатный агар, содержащий 15-25 мМ оксалата натрия, и инкубируют 2-3 сут.