Способ подготовки ферментных препаратов и реактивов для определения активности ферментов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 807 Союз СоветскихоциалистическихРеспублик(22) Заявлено 07.09.73 (21) 1960397/2851) М. Кл. С 07 п исоединением заявки -сударственный комитет вета Министров СССР о делам изобретений(72) Авторы изобретения Таран, 1 О. М. Шапиро и О. Я. Ище 71) Заявите кий политехнический институт асио(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ И РЕАКТИВОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ2 Изобретение относится к способам полготовки ферментных препаратов и реактивовдля определения активности ферментов врастительных и животных тканях и можетбыть использовано, например, в пищевой промышленности и при биологических исследованиях,Известен способ подготовки ферментныхпрепаратов и реактивов для определения активности ферментов в материалах, содержащих их, включающий добавление растворителя в форментный препарат и реактив.Однако такой способ не обеспечивает возможности определения активности ферментов при отрицательных температурах.С целью определения активности ферментов при отрицательных температурах в качестве растворителя используют водно-глицериновую смесь, содержащую дистиллированнуюводу и глицерин в соотношении 19: 1 - 1: 1,5, 20при этом после введения растворителя каждый полученный раствор охлаждают до температуры от 0 до - 40 С, затем смешиваютих и выдерживают при этой температуре,например, 2 - 3 час.25Способ осуществляют следующим образом.В ферментный препарат и реактив добавляют растворитель, в качестве которого используют водно-глицериновую смесь, состоящую из дистиллированной воды и глицерина в соотношении 19: 1 - 1: 1,5 соответственно.Полученные растворы форментного препарата и реактива раздельно охлаждают ло выбранной температуры в пределах от 0 С до минус 40 С, затем смешивают их н выдерживают при этой температуре, например, 2 - 3 час.Предложенный способ апробирован в лабораторных условиях лля определения активности пероксилазы при окислении его гваякола в присутствии перекиси водорода при температурах 0 С, 10 С и минус 1 О С.П р и м е р. На растворителе, содержащем дистиллированную воду и химически чистый глицерин в соотношении 1: 1,5, готовят 0,04 М раствор перекиси водорода и раствор пероксплазы нз расчета 1 г сухого хрена на 10 лл растворителя, и 0,1 М спиртовой раствор гваякола.Ферментный раствор, раствор перекиси водорода и спиртовой раствор гваякола раздельно охлаждают до минус 10 С, а затем смешивают 6 мл раствора ферментного препарата, 2 лгл спиртового раствора гваякола и 2 гял раствора перекиси водорода в термостатпруемой трехгорлой колбе со шлифамн, оснащенной термометром лля измерения м инусовых температур. При постоянном контроле в колбе поддерживают температуру - 10 С с точностью определения й 1 С.490807 где / - температура.На основе полученных данных установлено, что с понижением температуры активность пероксидазы понижается в соответствии с уравнением: 1 дК = п 1т,где п - коэффициент пропорциональности,зависящий от субстрата и концентрации пероксидазы,/ - температура,т - активность пероксидазы при 0 С,15 Способ подготовки ферментных препаратов и реактивов для одределения активности ферментов в материалах, содержащих их, включающий добавление растворителя в ферментный препарат и реактив, отличаои 1 ийся тем, что, с целью определения активности ферментов при отрицательных температурах, в качсстве растворителя используют водно- глицериновую смесь, содержащую дистиллированную воду и глицерин в соотношении 19: 1 - 1: 1,5, при этом после введения растворителя каждый полученный раствор охлаждают до температуры от 0 до - 40 С, затем смешивают их и выдерживают при втоц температуре, например, 2 - 3 час. 25 Составитель А. Бражникова Техред 3. Тараненко Редактор Л. Гончарова Корректор В. Гутман Заказ 145/201 Изд. 1 чз 108 ЦИИИПИ Государственного комитета по делам изобретений Москва, Ж 35, РаушскаяТип. Харьк. фил. пред. Патент Определение активности ведут спектральным методом по величине оптической плотности продуктов окисления гваякола, для чего из реакционной колбы периодически через 15 яин отоирают пробы микропипеткой по 0,1 - 0,2 лл, которые разбавляют в 10 - 20- кратном объеме водно-глицериновой смесью, что замедляет процесс окисления гваякола в течение времени спектроскспированпя. 10Замер оптической плотности разбавленного раствора ведут в стеклянных кюветах толщиной 0,5 - 5 сне на ФЭК-М при зеленом светофильтре или СФА при длине волны (Х), равной 480 н,ч. Для сопоставления активности ферментов при отрицательных и положительных температурах опыт проводят при 18 С, 0 С и - 10 С. 20 На основе кинетических кривых, построенных по данным спектроскопии начальную скорость процесса устанавлива 1 от по уравнению: где Й - оптическая плотность раствора,г - время, лик.30Затем величину К отождествляют с активностью пероксидазы и строят зависимость: Предмет изобретения Тираж 529 ПодписноеСовета Мшшстрсв СССРи открытийнаб д, 4/5