Способ получения связанных носителем протеинов

(11) 463268 Союэ Советских Социалистических Республик(61) Зависимый от патента 21) 1787934 23-5. Кл. 1 т 1/О 32) Приоритет 09.06.71 (31) Р 2128743.4 33) ФРГОпубликовано 05,03.75. Бюллетень Ха 9 Государственнын комитс. Совета Министров СССР по делам изобретений 53) УДК 678.765(088,8 откр ытн ата опубликования описания 04.09.75 2) Авторы изобретения Иностранцы лаус Букамп, Ханс Ульрих Бергмайер, Кар и Дитер Яворек(Австрия) Иностранная фирма Берингер Маннхайм ГмбХ(71) Заявитель СОБ ПОЛУЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ НОСИТЕЛЕМ ПРОТЕИНОВ(54) Изобретение относится к новому способу получения связанных носителем протеинов.Интерес к связанным носителем протеинам, особенно к связанным носителем ферментам, постоянно возрастает, и уже описано много веществ-носителей и методов фиксации, Однако только некоторые из известных до сих пор методов и веществ-носителей дают удовлетворительные продукты с высокой активностью и с хорошим выходом и достаточной стабильностью, Поэтому до сих пор в продаже имеются только некоторые связанные носителем ферменты, причем преимущественно речь идет об особенно стабильных протеолитических ферментах. Это объясняется тем, что более чувствительные ферменты или ферментные комплексы при фиксации по известным до сих пор методам или полностью теряют свою активность, или настолько неустойчивые, что не могут применяться для технических целей.Цель изобретения - разработка способа связывания протеинов с нерастворимыми носителями, т. е. получения продукта с высокой активностью, стойкого продукта, который может быть использован для технических целей,Известен способ получения связанных носителем протеинов, заключающийся в том, что неактивные протеины подвергают взацмодецствию с соединением, содержащим эпоксидную группу и двойную связь, способную к соцолимеризациц. Прц этом получают привитые 5 полимеры, используемые для получения во,"окна.С целью получения биологически активныхпродуктов предлагается в качестве протеинов использовать биологически активные протеи ны ц процесс осуществлять в водной среде, аполученный продукт подвергать сшиванию путем его взаимодецствия с акриламидом или дифункциональным сшивающим агентом. При необходимости в реакционный раствор могут 15 быть введены соцолимеризующиеся моцомеры,По способу согласно изобретению протеинобразует ковалентную связь с содержащим эпоксидную группу соединением при открывании эпоксидной группы. Полученцый таким цу тем промежуточный продукт без дальнецшеговыделения соединяется с соответствующим носителем, причем другая функциональная группа эпоксидного соединения вступает в реакцию с веществом-носителем.25 Вещество-носитель может вводиться как таковой в водный раствор для получения связи с промежуточным продуктом, цо может бытьгПЛУЧСП:З СаГОЗ ВДНОМ РаСтВОРЕ ПОЛИМЕРИ: .Г й 115113 р 13 ь 1 х мнмеро. При этом .рсдпч Гиге;у 1 цсствлять предлагаемый СГ:ОсО П 1 эс 131 эс 1 цсни 51 П 1 эОтеина с эпоксидным соединением в присутствии полимеризующегося мопомера ГЛи мономеров), или полимеризую;ппйся мопмер 1 или смесь мономеров) мо 51 е дО В;1 ятьс 51 13 1 эсакпионныи 1 эастВ 01 э лишьСлс рсапни между протеинм и энокспчным С С,1101111 С 31.,15 суп;сствлсния предлагаемого способа трсд 1 Оч Г итсльны эпоксидные соединения общей формулы которой 1( означает алкилсновый радикал с днй пли несколькими двойными связями, алчЛспокси 1 эадикал или НенасыщенныЙ ацильпый радикал; п -- 0,1 или 2; Я 2 - атом водорда или низшая алкильпая группа (под 1111.зпС 1 алкильпой группой понимается прямая ьи разветвленная группа с 1 - 4 атомами углерода). 1 рупца 1( содержит преимущественно 2 - -1 э атомоуглерода. Однако могут примени гься и более длипноцепочныс радикалы, поскольку при этом водорастворимость эпоксидного соединения уменьшается незначи: сльно.Примерами групп К Могут служить аллилкси-, мстилаллилокси, этилаллилокси-, диметилаллилокси-, метилэтилаллилокси, пропилаллплокси- и диэтилаллилоксигруппы, а также другие аллилоксигомологи, предпочтительна ацильная группа, в которой оксигруппа находится В сопр 51 яении с двойной связью, Подобшяс группы 1( образуются, например, от а,З-ненасыщенных кислот таких, как акрилоВая, метакриловая, фумаровая и малеиновая кислоты.Примерами соединений общей формулы 1 51 зляОтся 2,3-эпоксипропиловый сложный эфир акриловой и мстакриловой кислот, 2,3-эпоксипропиловый сложный моноэфир и диэфир малсиповой кислоты, 2,3-эпоксипропиловый сложньш моноэфир и диэфир фумаровой кис,Сты, 2,3-эпоксгбутиловый слоэз(ный эфир акриловоз кислоты, 2,3-эпоксипентиловый сложный эфир акриловой кислоты, 2,3-эпоксигексилсвый сложный эфир акриловой кислоты, соОтвстствуОщис сложные эфиры метакриловой, фумаргпэй и малеиновой кислот, 1-1 аллил( и) 2 3-ЭИзси(эзг 1 ан и . н. Особенно предпочтительны в качестве моно;Срш 3 Водорастворимые производные акрило и илп Ге 31 эилОВОЙ кислоты, нап 1 эиз 1 с 1 э амиды и сложныс эфиры этих соединений. Сосди 11 енпя с ограниченной водорастворимостью и. е;от преимущество в том случае, когда при- МЕП 51 СТСЯ СВЯЗВННЫЙ НОСИТЕЛЕМ фЕрМЕНТ В НЕ- чис 10 водной системе, например в водно-оргапп:ссой среде. Пригоды также соответствуюг 10 1 г 20 25 30 35 40 45 50 5 60 65 щие П 1 эоизводныс залеин 013 Й или фуза 130 ВОЙ 1(ИСЛ(3 ЬГ.В заиш 1 мс 1; г 1 эсбусз 1 Онсис 1 снции конечного продукта к мономеру добавля;о сшивающий агент, содержащип более одной полимеризующсйся группы, например Х,Х-ме. тиленбисакриламид и диэтиленакрилат, которые предпочитают при работе с водным раствором. Если полнз 1 еризацию ведут в гетсрогсшой фазе, т. с. суспспзии, могут примеяться такпс водоперас 1 оримыс сшивающис агенты, кк ДП 3315 лбеззог и эГН.Сндиметакрилат и др. 11 олучснныс по предлагаемому способу протсины, связанныс носителем, не образующим сшивки, можно сшивать дополнительно.Взаимодействие протеина с ЭГюксидным соединением не требует особых мероприятий: протеин и эпоксидное сосдипспис можно вводить вместе при нормальной температуре в водный раствор, целесообразно в буфсрвгй Водный раствор с величиной р 1-1, приемлемой для соответствующего протеина. 11 родолжительность взаимодсйстия протеина и эпоксидного соединения зависит от применяемых Веществ и колеблется от б мин до 1 час, но В отдельных случаях может быль более продолжительной пли более короткой.Взаимодействие протеина и эпоксидного соединения можно зссти В присутствии поситс или исходных 1 цэодуктов для получсния носителя. Б посл(днем случае нецелесообразно начинать реакцию полимсризации добавкой инициатора после образования проме;куточпого продукта протеина с эпоксидным соединением. В качестве ишциаторов могут применяться уп(згрсблясмыс обычно в химии полимеров инициаторы и катализаторы, так как опи нс оказывают отрицательного влияния на активность протеина. В качестве инициаторов или катализаторов нри применении мопомеров с ненасыщенными олефиновыми связями или форполимсров используОт, например, неорганические или органические перекиси, азосоединсния и т. д. 31 огут применяться такэке ускорители реакции, частности амины и т. и. 11 снользованис инициаторов в комбинации из перскисного сульфата и ами 1 а, например 3-димстиламинопро 1 ионитрила, предпочтительно, При применении иппциаторов в этой комбинации цслесооразно вести процесс В инертной агмосфере, например атмосфере азота. Продукт 11 олучакэ рстымтфильтровыанисм и промыкой.ПО предлагаемому спсобу чусзщГтсльныс 11 эгси 1 ы и П 1 эгсиновыс сосдинспи 51, ГзариГ 1 с 13 фс 1 эмс 11 ы, 3 ОэПО с 51311 агь бсз 001 ьшой потери их атпности. При фиксации на носислях подобных 1 у 1 зстзитсльных протеинов по известным мс 1 одам почти во всех случаях онн деза 11 вируютс 5 или получаемые препараты имеют небольшу 1 о стойкость и ограниченную активность. Преимущество получаемых по изобретению продуктов состоит В том, гго во рсмя процесс 13 их пабухаппя и других про 463268цсссов фермснтпос или цротеиновое соединение сохраняется. Это роявлястся, например, в том, что цри фиксации фермента уреазы на ДЕЛЕ-целлюлозе по известному триазиновому способу получают продукт с активностью 4,9 ед,/г, а по предлагаемому - с активностью 1200 ед,/г при той яе ферментативной активности, Причем и после хранения в течение нескольких цсдсль при температуре 34 С продукт не теряет активности. Лналогично по известному способу можно фермент глюкозаоксидазу с активностью 300 ед./г лиофилизата связывать с целлюлозой. Но после 11 дней хранения активность снижается менее чем на половину. По предлагаемому способу, используя одинаковые количества фермента, можно получать продукты почти с удвоенной активностью. Такие продукты сохраняются более 6 месяцев в готовой форме как катализаторы без существенного уменьшения активности.Продукты, получаемые по изобретению, стойки к поракению микроорганизмами, ре:ким цабухания их управляемыЙ, что Ва:окно, если продукты применяют для насадки колонны, кроме того, они обеспечивают легкое регулирование требуемого заряда или отсутствие заряда. Преимущество способа состоит также в простоте его осуществления.П р и м е р 1, Исходные вещества; глюкозаоксидаза (60 Р, 220 ед./мг) акриламид, 2,3- эцоксипропиловый сложный эфир акриловой кислоты, К,Х-метиленбисакриламид, 3-диметиламинопропионитрил, перекисный сульфат аммония.0,1 г С 00 растворяют в 2 мл. 0,5 М буферного раствора триэтаноламина (рН 8,0) в атмосфере азота при 30 С, смешивают с 0,25 мл 2,3-эпоксицропилового сложного эфира акриловой кислоты и перемешивают 30 мин. Затем охлаждают до 10 С, смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г Х,М-метиленбисакриламида, растворенного в 18 мл дистиллированной воды.В атмосфере азота приблизительно через 15 мцц начинается полимеризация при помощи 0,5 мл 5%-ного 3-диметиламинопропиоцитрила и 3 мл 5%-ного перекисного сульфата аммония, Раствор приблизительно через 5 мин становится вязким, затем он полимеризуется В желтьш прозрачный и твердый гель. Блок цолимсризации оставляют ца 18 час в холодильном шкафу. Далее полимеризат продавливают сквозь металлическое сито с отверстиями диаметром 0,5 мм и промывают 2000 мл дистиллированной воды. Частички геля помсщао в колонну внутренним диаметром 2 см с 0,2 М буферным раствором фосфата калия (рН 7,5), промывают адсорбционно связанной С 01), пока активность элюата не будет равна нуло, Фермецтативная активность связанного носителем фермента (лиофилизата) 500 ед,/г.Пример 2 (сравнительный пример). Повторяют пример 1, однако не вносят эпоксидное соединение.3,0 г акриламида и 0,1 г Х,М-метиленбисакриламида в 18 мл дистиллированной воды 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 смец 1 ивают, псрсмсшцвая и замораживая с 0,1 г С 00, расГорснной В 2 мл 0,05.51 буферного раствора триэтацолампна (рН 8,0). Заем, как в примере 1, в атмосфере азота добавляют раствор инициатора, ц продукт обрабатывают, как описано в примере 1, Лктцвность элюата около 40 оо от активности Введенного С 00. После лцофцлцзаццц полученного продукта дктиьцост лцофцлиздта состд- ляст от 90 до 100 сл,/г.Примср 3. Исходныс вещества: С 00-1, 220 сд./мг, акрцла 1 ид, 2,3-эпоксппроццловый сложны 1 эфир дкрцлоОЙ кислОты, Х,Х -51 етилснбцсакрцламцд, 3-дцметиламцнопропцоцитрил, псрскцсцьш сульфат аммония.0,15 г С 013 В 1,0 мл дстиллировдцОц Вод. и 1,5 мл 1,0 М буферного раствора трцэтацоламцна (рН 8,0) охлаждаОт в атмосфере азота до 10 С. Этот раствор разбавляют 3,0 г акрпламцда ц 0,1 г Х,Х-метцлсцбцсакрцламцдд, растворенного в 14 мл воды. Прц добавке в реакпцонный раствор 0,25 мл 2,3-эпоксцпроццлоого сло Иного эфира а 1 филово 1 кислот 1, 0,5 ъл 5%-ного 3-диметилдпшопроццоц 1 трцла ц 0,2 мл 5"-ного псрекисного сульфатд аммония начинается реакция цолцмсрцзациц. Время полимерпзацпи около 10 цш. Полцмеризационный блок продавливают сквозь металлическое сито ц обрабатывают, как описано в примере 1. Определение активности элюата показывает, что связывается ковалецтцо 1 ООО 1 О протеина. Лктивность лпофилцзата 140 ед./г. П р и м е р 4. Исходные вещества: С 00-1, 200 ед./г, ак 11 иламцд, 1-(аллцлоксц)-2,3-эцоксипроцан, М,Х-мет 1 ленбцсакрцла:5 Ид, 3-димстцламцпопропцонг рцл, псрекцсцый сульфат а. монця.50 мг С 00 в 0,5 мл дцсп 1 ллцроанной воды и 0,5 мл 1 М буферного раствора 1 рцэтацоламина (рН 8,0), растворенные в атмосфере азота прц 30 С, ц 0,1 мл 1-(аллцлоксц)-2,3- эпоксцпропана Выдерживают 40 мин, затем Охлаждают до 10 С, смешивают с 3 г дкриламида ц 0,1 г Х 1.х-метиленбцсакрцла 5 Ида, растворенного В 20 мл бцдпспллцровднцой воды. Дальнейшую обработку Ведут, как ОццСДЦО В ЦРЦМЕРС ,КГЦВЦОСТЬ ЭЛОД 11 СОСДВ- л 51 С Г 1 О /о От активности цс 110 льзоацнО 0 фермента. Лктивпост 1, лцофцлизата 210 ед./П р и м е р 5. Исходные вещества: урцказд, 4,5 ед./мг, растворенная В 50"; глцерцца, 0,05,51 глицин ц 0,13 М раствор ХаСО акрцлампд, 2,3-эцоксирошловй сложный эфир акриловой кислоты, Х,Х-мстцлецбцсакТцламид, З-дцмстцлдмццопроццоццтрцл, церскцсцый сульфат аммония.10 .г уриказы подВергдют дц 11 лцзул 0,01,51 буферного раствора глпццнд (р 1- 10) рц 4 С около 4 час. Дцалцзат смешиают с 1 мл 1 .Ч буферного раствора трцэтдцолдмцца (р 1-1 8,0). При 10 С В атмосфере азота ВыдсржпВот получл 111 у 10 смесь с добдв 1 сцце 51 0,1 мл 2.3-эцоксццрош 1 лового сложного эфира463268 11 рс.м тОбретен:я СОС И., ., РОсасЕВСИП 5Рел) иор Л. Ушакова 1 скреп М, Се 5 еиог Коррскто РГ, Лебедева 9 ЗОГ /"1 б И,; о 1 и;пи иб 1 о )и:сие Ц 1 ИИПИ 1 осударствеиио;о коми.еа Сове.а,)(и;истров СССР по делам изобретений и открытий Москва, К-Зб, Раушская иаб., д. 4/5Типграсии, ир Сапунова. ,акриловой кислоты при псремсшнваннн В гечение 30 мин. Оорабоку слут но нри.ору 1. Акт)иное гь лнофилиза га 3,0л./г.П р и м с р 6. Ис:олпьс ис)цсства: гсксокипаза, 140 сд./мг, акрила.,ил 23-эпоксирсппло- ВыЙ слокный э 1)и 13 ак 1 эилОВОЙ кпслоть, мстнлспб)сакрил а мпд, 3-дпметил а мшо ропно НРТ 1 И;1, НЕ 1 СКПСПЬ 111 СУГЬ 1)сЧ 1 МаОН;51.20 мг суснспзии крис галлоь гсксокипазь. растворяют в 5 мл волы и полвсрга от,чгализу в 1 л 0,0 М тфсрпого раствора грнэснОг- амина (р 1-1 8,0) при 1"С. В ирисустинп 2,3- эпоксип 1)онил 013 н О с,О 1.ОГО эфиРа а 1 ило 30 Й кислОты Вь)5 с 1 к 13 а 0 нолучсннмю с 3 Сс Б атмосфере азота прп 1 ОС с о;лаклене юслс 30 мин выдсржнвания ло 10 С. Раствор фсомента смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г М,М-МСТИЛЕпбпссЧКрЛаМНЛа, раСПЗОрЕПНОГО 20 мл лРс 1)г),нро)апп)й Золы. Дат ис(пук) ОбрабоГКу )3 СЛУ НО НрнМЕру 1. гГКИ)НОС 1 лпофилнзата 12 сд.,г.П р им ср 7. Искочпыс исцестиа: глюкозаОксидаза, 220 сл./мг (601.), 1,2-эпоксибутсп акриламил, Х,ХслспбРсакрила 3 ил, 3-летстела)ннопрониопе 11 ил нс 13 Спены 1 сульф а а 3 ъОИ е 5.100 мг 6013 и 2 мл 0,5 Ч буферного 1)нет 3)- ра трР)этанолам)ша (р 11 8,(, расцорчшон н апосфсрс азота прп 30 С, и 0,05 мл 1,2-энокснбутсна,4 выдсржниа:от и тсчсппс 30 к;ип. ЗсТСа 1 ОХЛс 1 К Ча 0 1 ЛО 1 О С, СССН 1 И 13 спо) С 3аКрИЛаМИда И 0,125 Г Х,МГ 3 Стна)енбпссК 1)ПГ)- амида, растворомныа.и и 18 мл бплпстнллпроВаННОй ВОЛЫ. Дс)Л ПсйШуЮ ОбрабЛКу веду НО примеру 1. ктР)ВРосэлюата 37 От н,рвоначальной активности исюдпог фермента. Ак)Р)вность лиофилизата 540 ел.,г.П р И М С р 8. ИСКОЛНЬ)С ВещЕСГ 3 а: Г,ККК)с- эксидаза, 220 сд./мг, эноксп 1)оп;3 оь) Сложный эфир акриловой кислоты, акриламид, Х,М-меплснбпсакриламид 3-лиметиламинонропиопнтрил, перекисный сульфат аммония,00 мг глюкозаоксидазы, растворенной в ат;,.осрсрс азота при 30 С в 2 мл 0,5 М буферного расио.а триэтаноламипа (рН 80), и 0,25 мл 2,3-эпоксипропилового сложного эфира акрилоиой кислоты выдерживают 30 мин. ;атса: раствор пееволяг в диализную камеру диа,изпая трубка ( Калле - целлофан)и лиажлы подвергают диализу в 1000 мл 0,05 Ч буферного раствора гриэтаноламина, рН 80. Г 1 ре,ЛсритСЛЬНО ИНКубнрОВВННЬШ раетиОр фЕр:сна (объем 10 мл) оклакла)от ло 1 ОС, объем гннс)гияк ло 20 мл билистиллированной )3,Ой, сисп;:Вают с 3 г акриламида и 0,15 г Х,Х- чсе)лснбСакриламида. Далее процесс )слуИо:римеру 1,."5 кИ)пост, элюата 5%, от первоначальной ак 113 ности пснользОВанпого фсрмснтаХкивпост дно 1)нгизата 305 сл./г. СНОСб:ОГу 1 СПИя С 35 Запп 1 с НОСИТСЛСК 1 Н 130- гсишш нггсо взаимодействия протеинов с сое- ,ННСННС 3. С)501 КсН 1)М ЭНОКСИДНУ 0 ГРУНУ И С ОС Оп Ми) К СОНОГ 1 И 31 С 1 нэс 1 ЦНН ЛВОЙНУЮ СВЯЗЬ, 0 1, 1с 10 Н И 1 С иСЪ) ЧТО, С ЦЕЛЫО ИОЛУС пия б 10 лонс)сскн акгР 1)ны; продуктов, в касест)с:Иг;с)но 3 используог биологически акгтп)п 110 н роСпи ы 1 И 1 Г)цесс Осуцест иля)От В волной срслс, а полученный продукт по,чвсрга- О с:нн 3 апн 0:утса 13;3 аиаОдсЙствия с акрилс)т.11,.,03 НГ 1 Н;1 ИфмпС Р 10 паЛЬНЫ 1 СпИВа 10111 РМ