Способ определения концентрации ионизированного в цитоплазме живых клеток

НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ОП Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(64 ОЗОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИИОНИЗИРОВАМНОГО Са В ЦИТОПЛАЗМЕЖИВЫХ КЛЕТОК(Я) 5 001 ХЗЗ 53 деления Са в цитоплазме клетки. Цепь: увепиче+2ние производительности исследований, экономное расходование исследуемого материала, расширение использования и упрощение способа Сущность изобретения: способ проводят в объединенных в стрипы микроюоветах, измерения проводят на фпуариметре, проба содержит компоненты в объемном соотношении суспензия клеток стимупируощий фактор: детергент. буфер = 42:1 до 40.Изобретение относится к области медицины, в частности к биохимии, и может бытьиспользованодлл измерения концентрацииионизированного Са 2 в цитоплазме живойклетки.Известны .способы определения концентрации ионизированного Са с использованием Фотобелка медузы аквеорина,который люминесцирует. при взаимодействии с ионизированным Са+ . Но дай способ обладает рядом существенныхнедостатков, главными из которых являются проницаемость мембраны для белка и,следовательно, трудоемкость способа.Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ определения концентрации ионизированногоСа+2 с использованием Флуоресцентного деривата ЕОТА, хелатора Са ооппАМ,Эфирную форму этого зонда добавляют ксуспензии клеток, благодаря этому зондбеспрепятственно проходит через мембрану в клетку, где неспецифические эстеразыгидролизуют эфир в его кислоту, которая+2образует хелатные комплексы с ионом Сачто вызывает увеличение флуоресценции,Известен также способ, заключающийся в следующем (Гуковская А, С., "Роль ионтранспортирующих систем и вторичныхмессенжеров в трансмембранной передачесигнала в лимфоцитах", дак.дисс.);.Подготовительный этап,Тимоциты выделяют путем измельчениятимуса крыс %1 этагпродавливаниячерезнейлоновый фильтр и отмывки центрифугироввнием доводят до рабочей концентрации 5 10 кл/мл, Жизнеспособность клетокоценивают поглощением трипанового синего. В процессе выделения клетки инкубируют в среде 199. Г 1 еред опытом клеткипереводят в стандартный солевой буфер,содержащий 5,5 вМ КО, 130 вМ йаО, 1 вМИа 2 НРО 4, 1 вМ КНгРО 4, 4 вМ йаНСОз, 1,3вМ СаО 2, 10 вМ НЕРЕЯ, б вМ глюкозы, рН7,1 - 7,3. Клетки нагружают красителем оип 2 АМ (рабочая концентрация 15 мкМ), инкубируют 40 мин при 37 С, отмывают открасителя и помещают в стандартный солевой буфер,Измерения.Суспензию клеток помещают в термостатируемую кювету и измеряют флуорес, центный сигнал на специальносконструированной (8. П. Зинченко, ИБФАН СССР) установке, представляющей собой комплекс спектрофлуориметра и термостатируемой ячейки, зонд-объективпогрукаетсл прямо в суспензию клеток, которая постоянно перемешивается магнитнрй мешалкой.где Гоп - интенсивность флуоресценцииопытной пробы;Гмакс - интенсивность флуоресценцииопытной пробы после стимуляции;Гмин - учет самофлуоресценции пробы,Гмин = 1/б ГмаксК - коэффициент диссоциации 9 апАМпри 20 С;400 - коэффициент пересчета на количество клеток в каждой микрокювете.Способ выполняется следующим образом.Подготовительный этап;Мононуклеары периферической кровивыделяют на градиенте плотности фиколлверографин, отмывают центрифугированием с 0,2%-ным раствором ЭДТА оттромбоцитов, Подсчет выделенных клетокпроводлт в камере Горяева по общепринятой методике, Жизнеспособность клеток50 оценивают по поглощению 0,2/-ного рас, -твора трипанового синего. Выделенныелимфоциты разводят 0,9/О-ным растворомИаО до рабочей концентрации 20 млн/мл.1 мл этой суспензии клеток нагружают 1 мкл55 15 вМ раствора ццпАМ. Окрашенныеклетки инкубируют 40 мин при 37 С, послечего отмывают центрифугированием и помещают в стандартный солевой буфер(ССБ),5 10 15 20 25 Но данный способ обладает рядом существенных недостатков: технически не выполним в условиях клиники (промышленностью не выпускается, в единственном экземпляре существуют в ИБФ АН СССР); - способ не экономичен в отношении исследуемого материала; - ограниченность практического применения в клинике из-за сложности способа и технического об-. служивания аппаратуры.Цель изобретения - увеличить производительность исследований, повысить точность измерений, экономно расходовать исследуемый материал, расширить практическое использование и упростить способ.Цель достигается тем, что после выполнения подготовительного этапа определение производят в обьединенных в стрипы микрокюветах, соблюдая при этом строго определенную последовательность их заполнения, обьемные соотношения вносимых ингредиентов, температурный и временной режим; расчет концентрации ионизированного Са производят по фор"2муле:Порядок заполнения микрокювет, режимы,В первый триполь вносят 20.мкл суспенэии лимфоцитов и 180 мкл ССБ; в третий -20 мкл суспензии лимфоцитов и 175 мклССБ; в третий - 20 мкл суспензии лимфоцитов, 10 мкл стимулирующего фактора (например, 10 мкл стандарта РдРга вконцентрации 100 пд/в 1, производства"Яегадеп", США) и 165 мкл ССБ.Микрокюветы с внесенными ингредиентами инкубируют при постоянном помешивании 15 мин при 20 С, после чего вовторой и третий трипли вносят 5 мкл 1 Мраствора дигитонина, микрокюветы повторно инкубируют в том же режиме 5 мин.Измерения.Проводят в трипле на флуориметре вмикрокюветах по программе: ЛазЬ га 1 е, 1,00вз, бе 1 ау с 1 гпе 0,02 вз, Мпс 1 оит 1 гпе 0,50 вз,с 1 еа 1 бее 10 пз,В отличии от прототипа определениепроводят в объединенных в стрипы микрокюветах, соблюдая при этом определеннуюпоследовательность их заполнения, обьемные соотношения вносимых ингредиентов;температурный и временной режимы; расд гчет концентрации ионизированного Сапроводят по формуле, где в отличии от прототипа коэффициент диссоциации цо 1 пАМ(К) взят для 20 С (из расчета на температуруокружающей среды) и количество клеток вкаждой микрокювете равно 400 тыс, Этоговорит о соответствии заявляемого решения критерию "новизны".Новые признаки. введенные в способ,никогда ранее в биохимии для достиженияпоставленной цели не применялись, что говорит о соответствии заявляемого решениякритерию "существенные отличия".Введение новых признаков в заявляемое решение позволит получить новый положительный эффект, увеличитьпроизводительность исследований, повысить точность измерений, расширить практическое использование, упростить способи экономно расходовать исследуемый материал,П р и м е р. Больной Карпушин И. Аистория болезни М 57370. поступил в клинику кардиологии ВМедА им. С. М. Кирова26,11,90 гс диагнозом: гипертоническаяболезнь 1 стадии.1. 05.12.90 г. произведен забор венозной крови в количестве 20 мл. Выделено 33млн/мл лимфоцитов, Процент нежизнеспособных клеток составил 3%, Приготовлено1,53 мл рабочей суспензии лимфоцитов. Постандартной схеме клетки нагружены зондом, отмыты и внесены в микроюкюветы. 5 10 15 20 25 30 35 40 50 55 Измерения проведены в трипле. Результаты: концентрация внутриклеточного ионизированного Са составила 0,051 мкМ,+гконцентрация внутриклеточного ионизированного Са после стимуляции лимфо+2цитов РЦЕга 0,043 мкМ.05.12.90 г, проведена функциональная проба с солевой нагрузкой (10 о -ным раствором йаС 1, внутривенно, капельно, 100 мл). Через 3 ч после пробы проведен забор 20 мл венозной крови. Выделено 9 млн/мл лимфоцитов, Процент нежизнеспособных клеток составил 57 ь, Приготовлено 0,43 мл рабочей суспензии лимфоцитов, По стан-. дартной схеме клетки нагружены зондом, отмыты и внесены в микрокюветы, Измерения проведены в трипле. Результаты: концентрация внутриклеточного ионизированного Са 0,069 мкМ. концентрация внутриклеточного иониэированного Са после стимуляции лимфоцитов Рд Рга - 0,056 мкМ.12,12,90 г. после проведенного курса терапии прозазином (по 0,001 г, 3 раза в рень, рег оз, 7 дней) произведен забор 20 мл веноэной крови. Выделено 12.,5 млнмл лимфоцитов, Процент нежизнеспособных. клеток составил 3 . Приготовлено 0,6 мл рабочей суспензии лимфоцитов, По стандартной схеме клетки нагружены зондом, отмыты и внесены в микрокюветы. Измерения проведены в трипле, Результаты: концентрация внутриклеточного ионизированного Са 0,094 мкМ, концентрация внутриклеточного ионизированного Са+г после стимуляции лимфоцитов Рдеть - 0,097 мкМ.1, Расширение практического использования способа и повышение точности измерений наглядно показано в приведенных примерах, Динамика содержания ионизированного Са в цитоплазме лимфоцитов (0,051 мкМ до долевой нагрузки, 0,069 мкМ после солевой нагрузки, 0.094 после курса терапии прозазином) и в цитоплазме лимфоцитов, стимулированных РдГга (0,043 мкМ до солевой нагрузки, 0,056 мкМ после солевой нагрузки, 0,097 после курса терапии прозазином), позволяет оценить; - чувствительность рецепторов клеток хозяина к Рдеть до солевой нагрузки, после нее и после терапии; - толерантность к солевой нагрузке, имеющей важное практическое значение при гипертонической болеэни; - проводимую терапию.Это имеет важное практическое значение в изучении патогенеза болезни и в выборе терапии (на примере гипертонической болезни)., Редактор А. Бер Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4% Заказ 3172 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 2. Увеличение производительности исследований и упрощение способа осуществляется в основном за счет использования обьединенных в стрипы микрокювет, что значительно облегчает и ускоряет работу исследователя,3, Экономия исследуемого материала (венозной крови) производится путем заполнения микрокювет по стандартной схеФормула изобретенияСПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНИЗИРОВАННОГО Са В ЦИТОПЛАЗМЕ ЖИВЫХ КЛЕТОК, включаю щий выделение.клеток, нагрузку зондом, отмывку и измерение фпуоресценции, отличающийся тем, что, с целью увеличения производительности исследований, повышения очности измерений, экономного расходования исследуемого материала, расширения практического использования и упрощения способа, определение провоме и с использованием малых объемов (20 мкл суспензии лимфоцитов).Способ высоко производитепен, экономичен в отношении расходования исспедуе мого материала и реактивов, прост идоступен в исполнении и может быть рекомендовай специалистам для широкого практического применения.(56) 3. Иааге, 1981, 1.опбоп 290, р, 527-528.10дят в обьединенных в стрипы микрокюветах, в первый трипль которых вносят суспензию.клеток, во второй - суспензию клеток и детергент, в третий - суспензию клеток, стимулирующий фактор и детергент, объем всех триплей доводят буфером до 200 мкл, при этом клетки инкубируют со стимулирующим фактором 15 мин, после 20 добавления детергена - еще Б мин при20 С, соблюдая во всех триплях обьемное соотношение суспензия клеток: стимулирующий фактор: детергент: буфер 4: 2: 1 -, 40.25