Способ определения сульфгидрильных групп в клетках крови

.В.Фаде научно-исследоватравматологии и аЧ где 1. и яч 8) ая Р.П, Суль Справочник и Ч циалов на .орой исслееремещается ектрическом ния раствол рным методам ред. Кост Е.А Б ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФУПП В КЛЕТКАХ КРОВИния к ним индикатора,щ и й с я тем, что, сния сульфгидрильныххности мембран клетокяют скорость перемерови в постоянномполе, до и после добавствора двухлористойой концентрации 0,60 ут Ч торои иссле перемещаетс лектрическо корость, с к дуемая клеткав постоянномполе после драствора двухлти, мкм/с,- радиус исследмкм. авленияристой р клетки е ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИДЕ"П:Л(54)(57) СПОСО ГИДРИЛЬНЫХ ГР путем добаьле отличаю целью определе групп на повер крови, определ щения клеток к электрическом ления к ним ра ртути в конечн,ЯО, 11 9 . А 0,65 ф 10 зМ и количество сульфгидрильных групп на поверхности мембр клеток крови (Н) определяют по фор мулеЯ = 6,48.10 (Ч - Чь 1. длина иэмерител ки, см;разность потен концах ячейки, скорость, с кот дуемая клетка п в постоянном эл поле до добавле ра двухлористои мкм/с;1 1101Изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно к определению сульфгидрильных групп в клетках крови.Известен способ определения сульф 5 гидрильных групп в клетках крови путем добавления к ним индикатора 13,.Однако этот способ выявляет лишь внутриклеточно расположенные сульфгидрильные группы и носит качествен- ный характер.Цель изобретения - определение сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови.Эта цель достигается тем, что со 15 гласно способу определения сульфгидрильных групп в клетках крови путем добавления к ним индикатора, определяют скорость перемещенияклеток кро 20 ви в постоянном электрическом поле до и после добавления к ним раствора двухлористой ртути в конечной концентрации 0,60-0,65 10 ЗМ и количество сульфгидрильных групп на поверх 25 ности мембран клеток крови (И)определяют по формулеИ = 6,48 .10 . (Ч - Ч),где Е - длина измерительной ячейки, см;Ч " разность потенциалов на концах ячейки, В;Ч " скорость, с которой исследуемая клетка перемещается 35в постоянном электрическомполе до добавления растворадвухлористой ртути, мкм/с;- скорость с которой исследуемая клетка перемещаетсяв постоянном электрическомполе после добавления раствора двухлористой ртути,мкм/с;а - радиус исследуемой клетки,мкм.Предлагаемый способ осуществляютследующим образом.Венозную кровь стабилизируют впробирке 3,87-ным раствором цитрата 50натрия в соотношении 4;1. Определяютсодержание эритроцитов и гематокритстандартными методами. Эритроцитыосаждают центрифугированием кровипри 1000 об/мин в течение 10-12 мин 55Плазма отделяется. Осажденные эритроциты разливают в две центрифужныепробирки по 0,5 мл, К ним добавляют 39 Ъпо 5 мл буфера Михаэлиса. После перемешивания смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, Надосадочную жидкость удаляют.В первую пробирку добавляют 0,25 мл 0,97.-ного раствора хлористого натрия (контроль), во вторую - 0,25 мл 0,6210 М раствора двухлористой-5ртути на 0,97-ном растворе хлористого натрия (опыт). После перемешивания смесь инкубируют 3-4 мин при комнатной температуре. После этого эритроциты отмывают буфером Михаэлиса. Из отмытых эритроцитов 0,02 мл разводят в 500 раз буфером Михаэлиса и используют для определения эиектрофоретической подвижности стандартным методом. Содержание сульфгидрильных групп рассчитывается по вышеприведенной формуле.П р и м е р. В пробирку, содержащую 1 мл 3,87-ного раствора .цитрата натрия, добавляют 4 мл венозной крови больного. После перемешивания определяют содержание в ней эритроцитов и гематокрит, В данном случае они равняются 3,5 10 в 1 мм и 387 соответственно. После центрифугирования крови при 1000 об/мин в течение 12 мин отделившаяся плазма удаляется, Осевшие эритроциты разливают в две пробирки по 0,5 мл, к ним добавляют по 5 мп буфера Михаэлиса. После перемешивания и центрифугирования в течение 10 мин надосадочную жидкость удаляют, а к эритроцитам в первой пробирке добавляют 0,25 мл 0,97.-ного раствора хлористого натрия, а во второй 0,25 мп 0,62 ф 10 ЗМ раствора двухлористой ртути на 0,97.-ном растворе хлористого натрия. После перемешивания и выдерживания при комнатной температуре эритроциты в обеих пробирках отмывают буфером Михаэлиса, Из обеих пробирок по 0,02 мл эритроцитов переносят в пробирки с мл буфера, Полученную взвесь используют для определения скорости перемешивания эритроцитов в электрическом поле. Определяют время, за которое клетки переместятся на расстояние 43 мкм. Для контрольных эритроцитов оно равнялось 3,28 с, для опыта - 2,84 с (среднее время из 20 измерений), Значение остальных параметров, входящих в формулу расчета для данных усСоставитель Е.ЖитниковаТехред С. МигуноваКорректор А.Ильин Р ед акт ор Н . Данкулич Заказ 4756/28 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Э 11017 ловий, равно: а - 3,6 мкм, Ь - 4 см, Ч - 25 В.Отсюда содержание сульфгидрильных групп в исследованных эритроцитах равно 27,2 1 ОЬ5Предлагаемый способ используют для исследования эритроцитов донорской и фибринолизной крови. Содержание сульфгидрильных групп на мембранах донорских эритроцитов 20,1+ 10 +1,0510", фибринолизных эритроцитов - 20,4+0,89 ф 10 В процессе хранения крови содержание свободных сульфгидрильных групп 15 на поверхности цитоплаэматической мембраны донорских эритроцитов снижается и равняется через 7 сут10,8+0,91 10Предлагаемый способ используют 20 для определения содержания сульфгид 39 4рильных групп в тромбоцитах. Установлено, что в тромбоцитах донорской крови оно равно 4,37+0.,5110 .В процессе хранения вьщеленных тромбоцитов при 4 С содержание сульфгндрильных групп на мембранах тромбоцитов быстро уменьшается и черезтрое суток равняется 0,67+0,17ОЬ.Содержание сульфгидрильных группна поверхности лимфоцитов, вьщеленных из фибринолизной крови, равняется 18,6412,07 10.Предлагаемый способ позволяет количественно определить изменение содержания сульфгидрипьных групп наповерхности мембран клеток крови,что отражает изменение биологическойактивности последних в процессе хранения и открывает новые перспективыдля совершенствования способов консервирования клеток крови,