Способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов

О П И С А Н И Е (и) 470531ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(51) М. К 13 сударственныи комитетовета Министров СССо лолам изобретенийн открытий 23) П.851.252(088.8) бликовано 15.05,75, Бюллетень18 Дата опубликования описания 26.08,75(54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ2 Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к методам извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, в частности стафилококков.Известен способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, включающий приготовление их суспензии, разрушение клеточных оболочек путем инкубации с лизоцимом и экстрагирование нуклеиновых кислот водонасыщенным фенолом. Однако этот способ не позволяет получить нуклеиновые кислоты с ненарушенной структурой из стафилококков из-за высокого внутриклеточного давления,Целью изобретения является получение из стафилококков нуклеиновых кислот с ненарушенной структу рой.Поставленная цель достигается тем, что суспензию стафилококков перед инкубацией обрабатывают диэтилэфиром и центрифугируют ее на холоде. Кроме того, для достижения плазмолиза, выпавший осадок стафилококков обрабатывают 15 - 25% -ны м р аствором хлористого натрия с последующим добавлением бидистиллированной воды до достижения концентрации физиологического раствора.Пример осуществления способа.На подготовительной стадии выращивают стафилококки, например, штамма209, Для этого в трехметровые сосуды заливают по 350 мл мясопсптонной питательной среды с рН 7,3 - 7,4 и заливают ее 1 мл 18-часовой бульонной культуры стафилококка, Культивирование проводят в течение 6 час в термо стате при 37 С на обкаточном аппарате дляперемешивания среды. Затем сосуды охлаждают до 4 С и центрифугированием прп 3000 об/мин в течение 50 - 60 мин отделяют стафилококки от культуральной среды, остат ки которой удаляют двукратной промывкойсуспензии микробных клеток физиологическим раствором, содержащим 0,5% цитрата натрия для ингибирования нуклеаз и центрифугированием после добавления каждой пар тии промывного раствора в указанном режиме. После этого приступают к выделению нуклеиновых кислот. Микробные клетки суспензируют в 50 мл физиологического раствора и экстрагируют равным объемом эфира в тече ние 10 мин при интенсивном встряхивании.Смесь центрифугируют в течение 45 - 50 мин при 4 С, при этом микробные клетки выпадают в осадок. На границе между верхним (эфир) и нижним (физиологический раствор) 25 слоями образуется кольцо, состоящее из липидов, экстрагированных при встряхивании.Описанную экстракцию липидов проводят повторно. В результате удаления липидов в клеточных оболочках стафилококка образуют ЗО поры,470531 Составитель О, СливкинаТекред Л. Казачкова Корректор Е. Рогайлина Редактор Н. Коган Заказ 1970/14 Изд. Мо 1434 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр Сапунова, 2 Микробные клетки, выпавшие в осадок, суспензируют в 2 мл 15 о -ного раствора хлористого натрия в течение 10 мин при тщательном растирании и перемешивании, Такая обработка вызывает плазмолиз и способствует проникновению фенола к протоплазме стафилококка через поры, образовавшиеся в клеточных оболочках, К суспензии микробных клеток добавляют 28,1 мл бидистиллированной воды до достижения концентрации физиологического раствора и инкубируют с 30,1 мг лизоцима с концентрацией 1 мг на 1 мл инкубационной смеси в течение 3 ч в термостате при 37 С (лизоцим - препарат для разрушения клеточных оболочек микробов, выпускаемый венгерской фирмой Реанал). После инкубации смесь становится вязкой, что свидетельствует о разрушении клеточных оболочек и выходе нуклеопротеидов в раствор. Инкубационную смесь охлаждают до +4 С и из нее экстрагируют нуклеиновые кислоты равным объемом (30,1 мл) водонасыщенного фенолапо методу Кирби-Георгиева. Предмет изобретения5 1, Способ извлечения нуклеиновых кислотиз микроорганизмов, включающий приготовление их суспензии, разрушение клеточных оболочек путем инкубации с лизоцимом и экстрагирование нуклеиновых кислот водона сыщенным фенолом, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью получения нуклеиновых кислот с ненарушенной структурой из стафилококков, перед инкубацией суспепзию обрабатывают диэтилэфиром и центрифугируют на холоде.15 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью достижения плазмолиза, выпавший осадок стафилококков обрабатывают 15 - 25 о -ным раствором хлористого натрия с последующим добавлением бидистиллирован ной воды до достижения концентрации физиологического раствора.