Способ определения поврежденияклеток ультрафиолетовым излучением

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М. Кл.з б О М 1/28 Гесударстеенный комитет Опубликовано 30.05.81. Бюллетень 20Дата опубликования описания 05.06.81пв делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения В. А. Крыленков, С. В. Левин и К. А. Самойлова Институт цитологии АН ССС 1 Заттвител Ф54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЛЕТОК УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ повреждезлучением щей спектвыядиях. Изобретение относится к медицинименно цитологии.Известен способ определенияния клеток ультрафиолетовым ипутем окрашивания их с последуюрофотометрией 11,.Однако данный способ не позволяетвить повреждения клеток на ранних ста Цель изобретения - выявление ранних стадий повреждения клеток.Поставленная цель достигается путем окрашивания клеток с последующей спектрофотометрией, при этом клетки окрашивают 0,01 - 0,015%-ным раствором альцианового синего и по содержанию красителя, сорбированного на клеточной мембране, определяют стадию повреждения клеток.Пример 1. Клетки асцитной гепатомы Зайделя получают от беспородных крыс весом 120 - 150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9% ХаС 1 при рН 7,4. Содержащиеся в растворе клетки 2 - 3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80 - 100 р. После отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию до 10 кл/мл.К 1 мл суспензии клеток, содержащей10 кл/мл, прибавляют 2 мл 0,015%-ного альцианового синего (АС). Конечная конл центрация красителя составляет 0,01%.Смесь инкубируют 30 мин, затем клетки осаждают центрифугированием при 27000 д в течение 15 мин при 4 С. Надосадочную жидкость, представляющую собой раствор Окрасителя, спектрофотометрируют в диапазоне 480 в 8 мм, концентрацию раствора АС после окрашивания им клеток определяют по величине максимального поглощения красителя при Я = 617 нм. После этого осадок окрашенных клеток промывают в 1 мл физиологического раствора (для удаления слабосвязанного с клетками альцианового синего) и еще. раз центрифугируют при 27000 т 15 мин при 4 С. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют в диапазоне 480 - 830 нм и по величине максимального поглощения красителя приА =617 нм определяют концентрацию остаточного и слабосвязанного красителя. Затем расчитывают коэффициент распределения слабосвязан834435 Концентрация окрашива-семой сусле нзии10 кл/мл Степень повреждения клеток повеличине летальной дозы Концентрация скрашиваемой суспензии 10 ф камл Вид поврежлений Абсолютные значения Я (безразмерная величина) Значени Я% от койтро ЗначенияЙ% отконтроля Абсолютные значения Я (безразмерная величина) 100 Контроль 430+ 59 100 790 + 190 0 Летальная доза 37% КУф ЙУФ 72 660 + 169 60 570 110 300 213 258 +123 84 72 Летальная доза 99 Фо 172+ 117150 й 113 40 368 + 147 35 400147 КУф 47 ДУф Немедленная гибель клеток 310+ 113 245 +108 К Уф 128 39 30.10020 с 86 85 20 31 Трипсин 40 мин 43 86 186 10 Коэффициент распределения красителя между поверхностью клеток и средой. Коротковолновое ультрафиолетовое излучение,иф длинноволновое ультрафиолетовое излучение. Как видно из таблицы, наибольшие значения коэффициента распределения красителя между поверхностью клеток и средой и, следовательно наибольшая сорбция альцианового синего поверхностью клеток были установлены для неповрежденных, (кон трольных) клеток.У клеток, облученных коротковолновыми и длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами в летальной дозе, снижающей опухолеобразующую способность клеток на 37%, значения коэффициента уменьшаются до 60 - 72% от значений коэффициента у неповрежденных клеток при окрашивании суспензии с концентрацией 106 кл/мл и до 72 - 84% при окрашивании суспензии с концентрацией 10 кл/мл, При облучении клеток 15 обоими видами ультрафиолета в дозе, снижающей их опухолеобразующую способность на 99%, значения коэффициента уменьшаются до 35 - 40% и 47 - 51% при окрашивании суспензий в концентрациях 10 и 10 кл/мл соответственно. Наименьшие значения коэффициента установлены для погибающих клеток, которые были необратимо повреждены воздействием высокой дозы коротковолновых ультрафиолетовых лучей, теплом или продолжительной инкубацией с трипсином. Значения коэффициента распределения у погибающих клеток в случае окрашивания суспензий в концентрации 10 и 10 кл/мл составляют 10 - 30% и 11 - 39% от контроля соответственно, Следовательно, .наиболее сильное снижение сорбции альцианового синего происходит у погибающих клеток.Предлагаемый способ позволяет рггистрировать по величине сорбции альцианового синего клеточной поверхностью степень (глубину) повреждения клетки, вызванного воздействием различных по своей природе агентов, причем такая регистрация возможна сразу по окончании воздействия повреждаю- щего агента.Способ позволяет значительно углубить представления о механизме повреждения клеток при действии ультрафиолетового излучения и показать участие деструктивных изменений клеточной поверхности в лучевом повреждении клеток, Кроме того, способ создает определенные предпосылки для расшифровки цитологического механизма повреждения клеток различным по своей физико- химической природе агентами, а не только ультрафиолетовым излучением, он позволяет диагностировать состояние поверхностных структур опухолевых клеток, которые в свою очередь обуславливают их способность к злокачественному росту.834435 Формула изобретения Составитель С. Малютине Редактор С. Тараненко Техред А. Бойкас Корректор О Билак Заказ 4002/62 Тираж 907 Подлисное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и о 1 крытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5 филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4Способ определения повреждения клеток ультрафиолетовым излучением путем окрашивания их с последующей спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с целью выявления ранних стадий повреждения, клетки окрашивают 0,01 - 0,015%-ным раствором альцианового синего и по содержанию красителя, сорбированного на клеточной мембране, определяют стадию повреждения клеток. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Третьяков А. В. Изучение действия гистонов на опухолевые клетки. в (сЦитология, 1974, т. 16,4, с. 481 - 485.