Способ подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов

.ЫЛ 1)5 С 12 Й 1/00, 7/ ИЕИ ТЕНИ ОПИС К ПАТЕ Н ИЯ ФАГОЛИЗИНИИ МИКРООРшчкина, Г. По икробиологическая ивирование микрое фаголиэиса при ооргвнизма, Сущоцессе культивирозмов вводят в гибитор фаголизиспольэуют хитоэан едпочтительно в коболее 0,01 мас,ф. ство СССР00, 1988,242462,тво СССР(56) Авторское свидетелМ 1439121, кл. С 12 И 1Патент Франции Мкл. С 12 В 1/24, 1976.Авторское свидетелМ 697562, кл. С 12 К 1/ Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу подавления фаголиэиса при культивировании микроорганизмов, находящему применение для защиты культур микроорганизмов от фаголизиса при промышленном культивировании.Цель изобретения - повышение эффективности подавления фаголиэиса, расширение спектра действия ингибитора и снижение его токсичности.Поставленная цель достигается тем, что в способе подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов путем введения в культуральную среду ингибитора фаголизиса, согласно изобретению, в качестве ингибитора фаголизиса используют хитоэан или его производные. Для более эффективного подавления фаголизиса целесообразно вводить хитозан или его производные в культуральную среду в конечной концентрации не более 0,01 мас.0 ф.Для удобства применения в качестве производных хитозана используют соль ор(54) СПОСОБ ПОДАВЛ СА ПРИ КУЛЬТИВИРО ГАНИЗМОВ(57) Использование: м промышленность, культ организмов, подавлен культивировании микр ность изобретения: в пр вания микрооргани культуральную среду и са, в качестве которого или его производные, пр нечной концентрации н 8 табл. ганической или неорганической кислоты хитоэана или смесь солей. В качестве соли органической или неорганической кислоты хитозана предпочтительно используют ацетат хитозана или гидрохлорид хитозана, или их смесь.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.В культуральную среду, применяемую для культивирования микроорганизмов, вносят ингибитор фаголизиса - хитозан или производные хитозана, предпочтительно в конечной концентрации не более 0,01%. Может быть использован хитозан различной молекулярной массы и степени деацетилирования. В качестве производных хитозана применяют соли органических кислот хитоэана (соли уксусной, молочной кислоты и других) или соли неорганических кислот хитоэана, например гидрохлорид хитозана, или смесь солей, Хитозан или производные хитозана вводят в культуральную среду. Процесс культивирования микроорганизмов осуществляют по известной мето 1830402дика. Для лучшего понимания настоящегоизобретения приводятся следующие примеры осуществления заявляемого способа.П р и м е р 1. Влияние хитозаиа иаинфекцию ЕзсЬег 1 сЫа соИ штамма В фагом Т 7.Ночную культуру ЕзсЬег 1 сЫа соИ штамма В в объеме 2 мл иа среде 1 Б вносят в 50мл среды М 9, Состав среды М 9 следующий;Алманий хлористый 1,0 гМагний сериокислый 0,13 гКалий фосфорнокислыйдвузамещеиный 3,0 гНатрий фосфорнокислый одноэамещеиный 6,0 гГлюкоза 4,0 гВода 1,0 лр.1 6,0Клетки выращивают на качалке при 200об/мин и температуре 37 С в течение 2 ч доконцентрации 5 10 клеток в 1 мл.Хитоэан растворяют в подкисленнойдистиллированной ваде да конечной конце трации его 0,1 мас.%, после чего рН полученного раствора доводят до 6,0.К суспензии клеток добавляют хитозаидо конечной концентрации 0,001 или 0,01мас,% и инкубируют 20 мин, после чего вводят фаг Т 7 с множественностью инфекции0,05. Смесь инкубируют до аступления лизиса в контрольной пробе (без добавленияхитозаиа). Бсе пробы цеитрифугируют дляосвобождения от остатков иелизироваиныхклеток, Наличие инфекционного фага выявляют в супернатанте каждой пробы глетодалатаровых слоев по Грация. Результаты испытаний представлены и табл. 1,П р и м е р 2. Влияние ацетата хитозанана инфекцию ЕзсЬегсз 1 а соИ штамгла Б 1фатам Т 7.Процесс проводят аналогична описанному в примере 1, Ацетат хитазана растворяют в дистиллированной ваде и вводят вкультуральную среду до конечной концентрации О, 001 или 0,01 мас.,4.Результаты испытаний представлены втабл. 2.П р и сл е р 3, Влияние смеси солейгидрахлорида и ацетата хитозаиа иа инфекцию ЕзсЬег 1 сЫа соИ штамма Б фагом Т 2,Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, Хитозан растворяют всмеси разбавленных соляной и уксуснойкислот, взятых в соотношении 1:1 до конечной концентрации его 0,1 мас.%, затем рНполученного раствора доводят до 7,0, Выпавший осадок смеси солей гидрохлорида иацетата хитозана отделяют и растворяют вдистиллированной воде. Полученный водный раствор солей добавляют к суспензииному в приглере 5,Результаты испытаний представлены в табл, 6.П р и м е р 7. Влияние ацетата хитозана иа инфекцию Вас цз ттцгп 9 епз 1 з 40 зцбзрес 1 ез 9 аИегае 1-97 фагом 1-978,Процесс проводят аналогично описанному в.примере 5,Результаты испытаний представлены в табл, 7,П р и м е р 8, Подавление хитозанам инфекции при спонтанной индукции фага в культуре ВасИцз йцгп 9 епзз зцбзресез цаИепае 1-97. 50 55 Начнуо культуру БасИцз йцгл 9 епз 1 з зцбзресез 9 аИегае 1-97 в абьеме 2 мл на среде 1 В вносят в 40 мл среды М 9. Клетки выращиваот на качалке при 200 об/мин и температуре 30 С в течение 4 ч, Б опытные пробы вносят хитозан до конечной канцеитрации 0,001 и 0,01и инкубируют в течение 2 сут. Затем все пробы центрифугируют для осаждения клеток бацилл, Супернатант анализируют на присутствие инфекционного фага, как описано в примере 5. клеток до конечной концентрации 0,001 или0,01 мас, Ь.Результаты испытаний представлены втабл. 3.П р и м е р 4, Влияние хитозана наинфекцию ЕзсЬег 1 сЫа соИ штамма В ФагамТ 2,Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, Результаты испытаний"О представлены в табл. 4,П р и м е р 5, Влияние гидрохлоридахитазана на инфекцию ВасИцз йцг 1 п 91 епзззцЬзрес 1 ез цаИегае 1-97 фатом 1-97 А,Ночную культуру БасИ 1 цз Отцг 1 п 9 епз 1 з15 зцЬзрес 1 ез цаИег 1 ае 1-97 в обьеме 2 мл иасреде 1 В вносят в 40 мл среды М 9, Клеткивыращивают иа качалке при 200 аб/мии итемпературе 30 С в течение 4 ч, Б суспензиа клеток добавляют гидрохларид хитоэа 20 на в виде его раствора в дистиллированнойводе до конечной концентрации 0,001 или0,01 мас,% и инкубируют 20 мин, после чеговводят фаг 1-97 А с множественностью инфекции 0,05. Слесь инкубируют в течение25 16 ч, Затем все пробы цеитрифугируют дляосвобождения от остатков нелиэираваииыхклеток, Наличие инфекционного фага в супериатанте каждой из проб выявляют методал атаровых слоев по Грация. Результаты30 испыта ий представлены в табл. 5,П р и м е р 6. Влияние хитозаиа иаинфекциа БасИ цз йцгп 91 епзз зцбзрес 1 ез9 аИегае 1-97 фатом 1-97 А.Процесс проводят аналогично описан1838402 Таблица 1 Таблица 2 блиц Результаты испытаний представлены в табл, 8,Предлагаемый способ по сравнению с известными способами позволяет повысить эффективность подавления фаголизиса при культивировании микроорганизмов.Согласно предлагаемому способу используют ингибитор фаголизиса-хитозан в концентрации, в 10 раз меньшей (не более 0.01 о ) при множественности инфекции в 500 раз большей (0,05) по сравнению с прототипом, в котором концентрация гексаметил ендиизоциа ната составляет 0,1 О , множественность инфекции 0,0001, При этом способ обеспечивает подавление инфекции на 95,5-100 О, Установлено, что хитозан и его производные эффективно подавляют лизис грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, вызываемый как экзогенными, так и эндогенными фагами, не оказывая при этом отрицательного воздействия на развитие культивируемых микроорганизмов и свойства культуральной среды. Способ характеризуется экологической безвредностью в связи с нетоксичностью хитозана и его производных и их способностью к полной биодеградации. Использование предлагаемого способапозволяет устранить фаголизис при промышленном культивировании микроорганизмов.5 Формула изобретения 1. Способ подавления фаголизиса прикультивировании микроорганизмов путем10 введения в культуральную жидкость ингибитора фаголиэиса, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения эффективностипроцесса, расширения спектра действияингибитора и снижения его токсичности, в15 качестве ингибитора используют хитозанили его производные,2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи й с ятем, что хитозан или его производные вводят в культуральную среду до концентрации20 не более 0.01 мас.,3, Способ по пп. 1-2, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве производных хитозанэ используют соль органической или неорганической кислоты или их смесь,25 4,Способпоп.З,отличающийсятем, что.в качестве соли органической кислоты используют ацетат хитозана, а неорганической - гидрохлорид хитозана,1838402 Таблица 4 аблиц Табли абл аблица, Состэвител Техред М Горяче рректо дакт ашков тета по изобретениа, Ж, Раушская изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 1 аз 2905ВНИИПИ Госу Тираж нного ком 3035, МосИ. Атабек оргентал одписное и открытиям при ГКНТ СССР б., 4/5