Способ получения мутантов чумного микроба

сОюз сОВетскихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 3149 ЕСПУБЛИК 9) 5 01 5 АТЕНТНОЕ ГОСУДАРСТВЕН.Ю ВЕДОМСТВО ССГ (ГОСПАТЕНТ ССС И ЗОБР ПИСАНИ ЕНТУ которых исполье ПМД на бакте(21) 4912994/13(56)Атчабаров Б.Б., Исин Ж.МСулейменов Б,М, Мутагенное действие полиморфноядерных лейкоцитов на Уегз 1 па резт 1 з//ЖМЭИ, 1989. гй 4, с.10-14.: Ауэрбах Ш, Проблемы мутагенеэа. М.: Мир, 1978, 178 с.Браун В, Генетика бактерий. М.: Наука, 1968, 249 с. Изобретение относится к микробиологии, генетике бактерий, в частности, к способу моделирования мутационной изменчивости возбудителя чумы.Целью изобретения является усиление интенсивности и специфичности мутагенного действия фагоцитов, и увеличение разнообразия типов получаемых мутантов,Это достигается тем, что живым грызунам в брюшную полость вводится суспензия бактерий. Смыв бактерий из брюшной полости производится после забивки животных через различные промежутки времени. Из экссудата бактерии высеваются на твердые питательные среды с последующим отбором мутантов,Известные способы. взуется мутагенное действи(54). СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ЧУМНОГО МИКРОБА(57) Использование: микробиология, генетика бактерий, в частности моделирование мутационной изменчивости возбудителя чумы. Сущность изобретения: чумной микроб вводится непосредственно в брюшную полость живых грызунов с последующим смывом бактерий после забивки животных, Выход фагоцитов в брюшную полость стимулируется предварительным за 6 ч введением 5 мл 0,1-ного раствора гликогена, затем интраперитонеально вводится 1-2 мл суспензии агаровой культуры бактерий в концентрации 1 10 -110 м.к,/мл. Смыв бактерий из брюшной полости производится 10,0 мл физиологического раствора с 0,25 ЭДТА с последующим высевом на твердые питательные среды и отбором мутантов. 2 табл. рии в опытах 1 п ч 1 тго с выделением из крови людей или из брюшной полости экспериментальных животных градиентным центрифугированием чистых пулов ПМЛ. производились в искусственной среде с участием лишь одного иэ компонентов фагоцитарной системы. Частота мутационных событий при моделировании изменчивости чумного микроба в опытах 1 и чтго (от 2,8 х х 10 до 1 106) оказалась ниже, чем при исполь)овании заявляемого способа (от 4 10 до 1 10 5), чему способствовали, более комфортные условия фагоцитирования в организме грызуна,Таким образом, сопоставительный анализ показывает, что заявляемый способ совпадает с прототипом по одному компоненту (применяется мутагенная активность ПМЛна бактерии) и отличается следующими положениями: чумной микроб вводится непосредственно в брюшную полость живых грызунов с последующим смывом бактерий после забивки животных, 5 Предлагаемый способ получения мутан тов может быть реализован на модели любого экспериментального животного с использованием различных видов бактерий,П р и м е р 1, Способ получения ауксотрофных мутантов чумного микроба из штам 10 ма Апри интраперитонеальном действии фагоцитов белых крыс,Иэ двухсуточной агаровой культуры штамма чумного микроба А - 1724 (выделен в Гиссарском природном очаге), растущего при 28 С на минимальной среде (МС), содержащей глюкозу, сульфит натрия, цистеин, метионин, фенилаланин, лейцин и 15 20 аргинин, готовят суспензию по стандарту набирают в шприц экссудат, и переносятего в центрифужную пробирку.Экссудат центрифугируют 10 мин при4000 оборотах/мин. Супернатант отсасывамутности(10 единиц) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток (м.к.) 1 10 в 1 мл.9Последовательным разведением пипеткойпереносят 0,5 мл суспензии в пробирки с 4,5мл физиологического раствора (ФР) до концентрации 1 10 м.к./мл,Белой крысе интраперитонеальношприцем вводят 5 мл 0,1; стерильного раствора глюкогена. Через 6 час белой крысе 30вводят интраперитонеально 1 мл суспензиис концентрацией 1 10 м.к./мл.8Через один час усыпляют животное парами хлороформа, металлическими приколышами фиксируют на вскрывочной доске,продольным разрезом ножницами рассекают кожу по средней линии живота (все манипуляции проводят стерильныминструментом) и короткими поперечными(по 2 см) - к каждой лапке, придерживая 40свободный край кожи хирургическим пинцетом, отсепаровывают кожу, освобождаябрюшную стенку. Брюшную стенку протирают спиртовым тампоном и внутрибрюшинно вводят шприцем 10 мл 45физиологического раствора с 0,25 ф зтиленэминотетраацетатом (ЭДИА). Захвативпинцетом складку брюшной стенки. слегкапокачивая животное, распределяют введенный раствор. Придерживая пинцетом складку брюшной стенки, ножницами делаютпродольный разрез (2 см), в брюшную полость вводят стерильный марлевый тампон(1 см на 1 см) и под защитой тампона длинной иглой (более 5 см) со сточенным концом 55. ют пипеткой, а к осадку прибавляют 2 млфизиологического раствора, Последовательным разведением пипеткой переносят0,2 мл суспензии в пробирки с 1,8 мл ФР(дочетвертого разведения) и из каждого разведения производят высев по 0,1 мл на пластинки а гара Хоттингера. Чашкиинкубируют при 28 С, а разведения хранятпри 4 С,Учет выросших колоний производят через 24 часа и из разведения с оптимальнойконцентрацией микроорганизмов (рост 60 -80 колоний) производят высев пипеткой по0,1 мл на пластинки.агара Хоттингера.Через 24 - 48 часов инкубации при 28 Спроизводят отпечатки колоний с чашки бархоткой, закрепленной на текстолитовойкруглой пластинке меньшего, чем дно чашкиПетри диаметра, методом "реплик" по Д.Ледерберг, Е.Ледерберг (1952) на пластинки МС,На 2-3 сутки инкубации при сличениичашек с агаром Хоттингера и МС, отбираютварианты, которые растут на полной средеи не растут на минимальной, Такие субкультуры высевают на селективные питательныесреды, содержащие компоненты МС с добавлением дополнительных факторов роста(табл.1),Таким образом, результаты опыта позволяют сделать вывод о получении ауксотрофных мутантов чумного микроба.Частота мутаций на количество высеянных клеток для никотинамидэависимых ауксотрофов составила - 4 10, длятриптофанзависимого - 1,2 10Таким же способом, наряду с другимиауксотрофами, получен и цитидинэависимый мутант чумного микроба.П р и м е р 2. Способ получения различающихся по вирулентности мутантов чумного микроба из штамма М 224 приинтраперитонеальном действии фагоцитовбелых крыс. Из двухсуточной агаровой культуры чумного микроба М 224 (выделен в Устюртском природном очаге, вирулентен для морских свинок (Оно 177 м.к,) готовят суспенэию по стандарту мутности (10 единиц) в эабуференном физиологическом растворе (рН 7,2 с концентрацией микробных клеток 1 10 в 1 мл. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в пробирки с 4,5 ФР до концентрации 1 10 м.к./мл.Белой крысе интраперитонеально шприцем вводится 5,0 мл 0,1 стерильного раствора гликогена. Через 6 часов вводятинтраперитонеально 2,0 мл суспензии бактерий в концентрации 1,10 м.к,/мл.7Через три часа усыпляют животное парами хлороформа, металлическими приколышами фиксируют на вскрывочной доске, 5 продольным разрезом рассекают кожу по средней линии живота (все манипуляции проводят стерильными инструментами) и короткими поперечными (пор 2 см) - к каждой лапке, придерживая свободный край 1 О кожи хирургическим пинцетом, отсепаровывают кожу, освобождая брюшную стенку. Брюшную стенку протирают спиртовым тампоном и внутрибрюшинно вводят 10,0 мл ФР с 0,25;4 ЭДТА. Захватив пинцетом 15 складку брюшной стенки, слегка покачивая животное, распределяют введенный раствор. Придерживая пинцетом складку брюшной стенки, ножницами делают продольный разрез (около 2 см), в брюшную 20 полость вводится стерильный марлевый тампон (1 см на 1 см) и под защитой тампона, длинной иглой (более 5 см) со сточенным концом набирают в шприц экссудат и переносят его в центрифужную пробирку. 25Экссудат центрифугируют 10 мин при 4000 оборотах в минуту. Супернатант отсасывают пипеткой, а к осадку прибавляют 2 мл ФР. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,2 мп суспензии в про бирки с 108 мл ФР (до четвертой пробирки) и из каждого разведения производят высев по 0,1 мл на пластинки агара Хоттингера. Чашки инкубируют при 28 С, а разведения хранят при 4 С. 35Учет выросших колоний производят через 24 часа и из разведения с оптимальной концентрацией бактерий (рост 60 - 80 колоний) производят высев пипеткой по 0.1 мл на пластинки агара Хоттингера, 40Через 48 часов инкубации проводят ориентировочное определение вирулентности полученных субкультур на морских свинцах, Для этого из каждой субкультуры готовят суспензию (как описано выше), по следовательно разводят ее до концентрации 1 10 м,к./мл и 1,0 мл этого разведения бактерий вводят подкожно трем морским свинкам в область верхней треги бедра.Учет результатов в течение 10 суток (острый инфекционный процесс), При наличии субкультур, не приведших к гибели животных в указанные сроки, проводят аналогичную описанной титрацию таких субкультур и заражают подкожно на каждую дозу по 4 морских свинок по 1,0 мл из разведений 1 10,1 10,1 10,1 10,1 10 м.к,/мл. Сравнение вирулентности полученных мутантов проводят через 10 суток по количеству погибших животных с бактериологическим подтверждением инфекционного процесса (табл.2).Таким образом, результаты позволяют сделать вывод о получении мутантов чумного микроба с различной вирулентностью,Технико-экономическое значение заявляемого способа заключается в том, что частота мутаций выше в сравнении с прототипом 10 - 100 раз; используется мутагенное действие обоих элементов фагоцитарной системы (ПМЛ и МФ) с участием естественных факторов регуляции фагоцитоза; заявляемое решение будет способствовать изучению генома вирулентности чумного микроба и других патогенных бактерий, популяционных взаимоотношений носителей и возбудителя чумы, решению проблемы возникновения экотипов возбудителя с различной вирулентностью,в природных очагах, что позволяет улучшить рациональную схему профилактики чумы.Формула изобретения Способ получения мутантов чумного микроба, предусматривающий обработку чумного микроба мутагенным фактором, высев на плотную питательную среду и отбор мутантов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработку чумного микроба осуществляют путем введения с 7 успензии микроба в концентрации 1 10 - 1 10 м.к,/мл в брюшвную полость живым грызунам при экспозиции 1 - 6 ч, а плотную питательную среду засевают смытыми из брюшной полости микробами,1831499 Таблица 1 Ауксотрофные мутанты чумного микроба, полученные при интраперитонеалном действии фагоцитов белой крысы на штамм У.резт з Аблица Сравнительная вирулентность для морских свинок мутантов штамма Ю 224,полученных при интраперитонеэльном действии фагоцитов белых крысСоставитель Б.АтчабаровТехред М.Моргентал Корректор М.Тка ак каз 2541 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035,Москва.Ж. Раушская наб,; 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгоро