Способ повышения иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба

со 1 оэ советскихсоциАлистическихРЕСПУБЛИК 2 С 1 1 РЕТЕНИЯ ТВУ ОСУДАРСТВЕННИЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗО К АЮТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(53) 576.8.093.35 (088.8) (56) Леви М.И Чекомасов А.В Васильев Н.В. Изучение возможности повышения приживаемости и иммуногенностн живой авирулентной вакцины против чумы. Пассирование вакцинного штамма 1 на белых мышах, - Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1960, 8, с. 105-117. 801249939 А 1(54)(57) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕН.НОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ЧУМНОГОМИКРОБА путем пассирования культурымикроорганизмов с последующим выде-лением культуры, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа, пассирование проводятчерез культуру макрофагов, субкультуру чумного микроба добавляют кмакрофагам в соотношении 50: 1, инкубируют в течение 20-24 ч и для последующего пассажа используют микробные,клетки, выделенные из разрушенного монослоя макрофагов предыдущегопассажа.1 12499Изобретение относится к медицинской микробиологии,Целью изобретения является ускорение способа эа счет исключенияиспользования зивого организма.Способ иллюстрируется следующимипримерами.П р и м е р 1. Перитонеальныемакрофаги получают промыванием брюшной полости морских свинок 20 мл 10среды 199 с гепарином (5 ед/мл),содержащей 203 сыворотки крови человека, инактивированной при 56 С втечение 30 мин, Определяют концентрацию макрофагов путемподсчетав 15камере Горяева и добавляют взвесьсубкультуры У, резСхз ЕЧ, выращенной в течение 1 сут, при 28 С наагаре Хоттингера (рН 7,2) таким образом, что соотношение количества 20макрофагов и числа микробов составляет 1:50. Приготовленную взвесь макрофагов с бактерияии разливают по 1 мл в 25 стерильные пенициллиновые флаконы (по 3-4 флакона на одну субкультуру), которые закрывают стерильными резиновыми пробками и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. За это время 30 макрофаги прикрепляются к стеклу, после чего флаконы вынимают из тер мостата. Прикрепившийся слой клеток промывают средой 199 для удаления неприкрепившихся клеток.и внеклеточно расположенных микробов и заливают 2 мп среды 199, содержащей 203 инактивированной сыворотки крови человека. Среду заменяют свезей через 6-8 ч культивирования при 37 С и про-щ должают инкубировать при этой тем-пературе еще 13-15 ч (всего 20-24 ч), после чего среду культивирования сливают и к оставшемуся на стенке, флакона слою макрофагов добавляют 0,2 мп дистиллированной воды, осторожно снимают пипеткой монослой макрофагов и фпакон встряхивают. Иакрофаги при этом разрушаются, и расположенные внутри них микроорганизмы высвобоздаются. Полученной вэвесью; микробов, собранных из 3-4 флаконов (первый пассаж субкультуры), инфицируют свежие макрофаги для получения следующего пассажа. Всего проводят20 пассажей.Параллельно проводят пассирование этойже субкультуры У. резсз Е 7 на морских свинках массой 250-300 г,39 2Двусуточную культуру, выращенную при28 С на агаре Хоттннгера (рН. 7,2),вводят подкозно в дозе 5 10 микробных клеток 2-3 морским свинкам, Таккак животные от указанных доз не погибают, нх забивают на 5-7-е сутки,делают высевы из места введения культуры, лимфатического узла, печени, "селезенки на соответствующие питательные среды и полученной субкультурой вновь заражают животных. Всегопроводят 20 пассажей.Иммуногенность исходных .и пассированных субкультур определяют на белых мышах массой 18-20 г по крите рию Хш 0 - количеству микробныхклеток, способных предохранить через 21 сут 503 взятых.в опыт животных от 200 ВС 1 вирулентного штамма:чумного микроба. В качестве вирулентйого штамма используют У. ревй.э361(1)- 1479, 1 ПС 1 которого составляет 25 микробных клеток. Полученныерезультаты приведены в табл. 1, изкоторой видно, что используя предлагаемый способ, мозно значительноповысить иммуногенность вакцинно 1 оштамма чумного микроба и в болеекороткий срок, чем при пассивировании обычным способом. Так ХшВ еубф 6 акультуры 10 пассажа на макрофагахсоответствует ХшВ субкультуры 20пассажа на морских свинках и в25 раз превосходит Хпй исходнойсубкультуры. Дальнейшее пассирова-,.ние на макрофагах еще больше повышает иммуногенность субкультур.Так, ХшЭ .субкультуры 20 пассажана макрофагах в 70 раз превосходитХшЭ, исходной субкультуры и значительно выше Хшй субкультуры, пассированной 20 раз на морских свинках,Данные по количеству жизнеспособнык микробов при использовании макрофагов приведены в табл, 2,Способ позволяет быстро повыситьиммуногенность субкультур вакционного штамма чумного. микроба. Для получ ния одной и той же величины иммуногенности предлагаемым способом(п чхйго) требуется 10 пассажей,а обычным (3.п чиччо) - 20. Еслиучесть, что каздьм пассаж Ы чдйгозанимает 1 сут, а п чиччо - 1 О сут,то один и тот же иммуногенный эффектдостигается способом по изобретениюв 20 раз быстрее, чем.известным способом (10 дней вместо 200 дней соответственно).1249939 Таблица 1 Данные по иммуногенности вакцинного штамма чумного микроба 1 шй 1 шЭ 50 мин 50 маке Субкультура 1 вй5 о 50000 Исходная 24400 130000 50000 24400 130000 6000 3160 11480 1050 3800 520 1900 20 700 360 1350 50000 24400 130000 16800. 7760 28200 11480 3160 8000 4800 Таблица 2 Количество жизнеспособных чумных бактерий вмонослое макрофагов в зависимости от микробной нагрузки:10 бов внутр 10-15 Ж мак чумные бак в содержат2000г1300 80-90 Ж мак микроколон роба (50-9.1,5 д 10 (5 е 10-4 е 10 ) Редкий слой макрофагов; оставшиеся на стекле макрофагиразрушены, внеклеточно расположенные микробы 1: 100 На стекле единичные разрушенные макрофаги, клеточныйдетрит 1200 Количество микробов определяют высевом ряда десятикратных разведений на агар Хоттингера (рН 7,2). Учет осуществляютчерез 48 ч инкубации при 28 фС,Составитель В. ДроздовТехред Н,Глущенко Корректор Л, Патай Редактор Е. Хорина Тираж 500 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5