Способ получения ауксотрофных мутантов бактерий

(19) 01) 4 С 12 Б 15 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ АНИ БРЕТЕН К АВТОРСКОМУ СВИ ЛЬСТВУ 8-14 кул вии вательМикроб" ле н итутщ и ния вир е 1 М. СЬеьпорЬуз. Везр.788-795. СМг Сощш ер асаци(21) (,22) (4 б) (71) ский (72) (53) 3781721/ 18.08.84 30.10.87 Всесоюзн противоч А.Н.Кули 5751(08 Айе 1 Ьегя асЬеп С-В цп. 1965,Бюл. Уй научноумной инсченко8.8)Е.А. Мап1 осЬещ. В18, У 5(57) СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ АУКСОТРОФМУТАНТОВ БАКТЕРИЙ, включающий тивирование бактерий в присутстнитрозогуанидина с последующей тивацией мутагена, о т л и ч а ю . й с я тем, что, с целью ускореспособа,., нитрозогуанидин инактиуют путем добавления к взвеси бакй в растворе мутагена щелочного твора унитола до конечной конценти 0,25-0,5 Е..1 128Изобретение относится к микробиологии, а именно, к генетике микроорганизмов.Целью изобретения является ускорение способа,Способ осуществляют следующим образом. Обрабатывают бактерии нитрозогуанидином (НГ), затем к суспензиибактерий в растворе.мутагена добавляют щелочной раствор унитола до конечной концентрации 0,25-0,5 Е. Через3-5 мин нитрозогуанидин полностьюинактивируется.Способ обработки на бактериях семейства ЕпгегоЬасгегасеае, в том числе на Уегзпа резГ 1 з, удобен приработе с вирулентными микроорганизмами.П р и м е р 1. Получение 1 еп мутантов штамма Е. со 1 С(1 ец,СЬг, 1 Ь) . Обработку бактерий Е.со 11Снитрозогуанидином (НГ) проводятв 2 мл 0,2 н ацетатном буфере прирН 5,5. Время обработки 20-30 мин,концентрации мутагена 0,3-1,0 мг/мл,После этапа обработки бактерий нитрозогуанидином к 2 мл суспензии клетокв растворе мутагена прибавляют равный объем 1 Е-ного раствора унитиола(до конечной концентрации 0,5 Е) и0,5 мл 0,1 н раствора ИаОН.Спустя3-5 мин производят высев культурына агар с минимальной средой (без4.лейцина) для выявления 1 еп мутантов.П р и м е р 2. Получение ауксотрофных мутантов штамма чумного микроба.Бактерии обрабатывают нитрозогуанидином, как в примере 1. После мутагенной обработки к 2 мл суспензиибактерий в растворе нитрозогуанидина добавляют 2 мл 1 Е-ного раствораунитиола в щелочном бульоне Хоттингера (для приготовления щелочногобульона и 15 мл бульона добавляют0,4 мл 1 н раствора ИаОН), рН конечной смеси после добавления раствораунитиола должна быть равна 7,2. Затем проводят этап фенотипическойэкспрессии мутантов: бактерии подращивают в полученном после добавленияунитиола растворе в течение 14 ч,после чего высевают на плотную питательную среду (агар Хоттингера) дляполучения изолированных колоний, которые дентифицируют по питательнымпотребностям. П р и м е р 3. Проверк возможноймутагенности продуктов взаимодействия нитрозогуанидин с унитолом.5В опыте использовали штамм Ба 1 ш.гурйтцгцт ТА 100(8), обладающийотносительно высокой частотой спонтанных мутаций, вследствие наличиямутагенных свойств у общепринятыхпитательных сред, и использующийсяспециально для выявления мутагенности, которая оценивается по частотереверсии от Ьз к Ьз+. Штамм несетмутацию типа замены оснований, аналогичные изменения ДНК в основномвызывает и нитрозогуанидин.Готовили разведения нитрозогуанидина в ацетатном буфере (рН 5,5) сконцентрацией НГ 1,0, О,1,0,001 мг/мл. К растворам нитрозогуанидина добавляли раствор унитиола всинтетической среде до получения конечной концентрации унитиола 0,257.и 0,1 н раствор ИаОН для достижения25 рН 7,2,.Смесь выдерживали 2-3 мини вносили 1 каплю односуточной культуры штамма Ба 1 гп. :урйппцг 1 цгп ТА 100.Параллельно культуру вносили в про,бирки с растворами нитрозогуанидина30 без унитиола (вместо унитиола добавляли синтетическую среду) и в пробирки с раствором унитиола без нитрозогуанидина. Через 2 суток отмечалирост в пробирках и делали высев начашки с синтетической средой (8) дляподсчета Мз+ ревертантов и определения уровня мутагенеза.Продукты инактивации нитрозогуанидина унитиолом (при нормализации рН4 О среды) не оказывают на клетки летального действия, и они способны растии размножаться в смеси НГ с унитиолом, Результаты изучения мутагенности для клеток продуктов инактивации45 НГ унитиолом свидетельствует об отсутствии таковой. Так, частота образования мутантов бактерий, выросшихв смеси, полученной после инактивации НГ унитиолом, в том числе и призаведомо высокой концентрации НГ(1,0 мг/мл), практически не превышает частоту образования мутантов,выросших в присутствии одного унитиола. В то же время у клеток, выросшихв присутствии не инактивированногоНГ (концентрация НГ 0,001 мг/млмаксимальная концентрация мутагена,при которой имеют место рост и размножение бактерий данного штамма)Составитель Н.КузенковаТехред И.Попович Корректор А.Обручар Редактор А.Купрякова 5204 Тираж 499БНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий3035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Заказ Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4. з 2857854частота образования мутантов возрос- центрации последнего 0,257) не облала почти в б раз по сравнению с дают мутагенной активностью.клетками, выросшими в присутствии Использование предлагаемого спосо" инактивированного унитиола нитрозо- ба по сравнению с известным обеспечи 5гуанидином. вает следующие преимущества: позволяет экономить время (30-40 мин наТаким образом, можно сделать за- пробу), не требует эксплуатации центключение, что продукты инактивации рифуги, что приводит к зкономии элекнитрозогуанидина унитиолом (при кон- троэнергии.