Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае, используемый для получения фимбрий

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК б 07 И 1/20, А 61 К 39/02 ОПИСАНИ ОБРЕ И ПАТЕНТ г 1) 22), 4 О еют фимбх фимбрии ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены и Ростовский медицинский институт (72) Л.Д.Мартыненко, Я.П,Землянкина, и Г.А.Вилков(73) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены (56) 01 Ь. Э,С,О 1, Мед. И 1 сгоЬо 1.1985, - Ч. 20, И 20. - Р. 203-204.ТАММ БАКТЕРИИ КЬЕВБ 1 ЕЬЬА РИЕБИСПОЛЬЗУЕМЬТ 1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности кбиотехнологии, и может найти применение в технологическом процессе получения фимбрий. Последние могутбыть использованы для получения специфических антисывороток и созданиюна их основе диагностических препаратов,Цель изобретения - изыскание штамма, стабильно продуцирующего фимбрии, использование которого упрощаетспособ получения Фимбрий как антигенного препарата,Отечественных аналогов зарегистрировано не было. Лтамм К. рпецпюпзае был выденен из клиницеского материала больного диареей, депонированв коллекции Государственного научноисследовательского института стан(57) Использование: медицинская микробиология, диагностический препарат, антисыворотка, Фимбрии К. рпеипюпдае. Сущность изобретения: новыйштамм К 1 еЬзе 11 а рпецпюпае ТУСКЮ 206 стабильно продуцирует фимбрин.Его использование упрощает способполучения Фимбрий как антигенногопрепарата.Получают Фимбрии путем выращивания на жидкой или плотной питательной среде осаждением биомассы,дезинтеграции на механическом дезинтеграторе и центрифугированием при10000 в течение 30 мин. Супернатантсодержит Фимбрии КФА, дает реакциюагглютинации с антисывороткой в титре 1:32-1:64. 4 пр, 1 табл. дартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им, ЛА.Тарасевича за М 206,Свойства штамма К, рпешпопйае 8 ф 206.Морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, неподвижны, жгутиков и опор не образуют. При окраске в тушевом препарате по Бурри установлена продукция капсулы,размер которой достигает до 1/2 диаметра тела бактериальной клетки. ф Электронно-микроскопические данные; палочки с закругленными концами, размер клетки - длина 1,810,19 мкм при в=953, ширина 1,04 Ф 0,03 мкм при в= . =954. При просмотре более 2000 клеток жгутики не обнаружены.Бактериальные клетки имрии, процент клеток несущи( l 953, 0,1726). Фимбрии располагаются перитрихиально более 100 на каждой клетке,Культуральные признаки. На мясопептонном бульоне через 3 ч при370 С наступает легкое диффузное помутнение среды, через 16-18 ч - помутнение с легкой пленкой. На плотныхпитательных средах через 18 ч при374.0,5 С образуют колонии, которыевыглядят следующим образом:на среде Эндо: колонии темнорозового цвета (лактозопозитивные)с более темной окраской в центре,выпуклые с легким металлическим блеском, маслянистые, диаметр колоний1,5-2,0 мм, Признаков диссоциациинет. 20на среде К; колонии светло-жел 2того цвета с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1,0-1,5 мм.Признаков диссоциации нет. 25на мясо-пептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, легкоснимаются, диаметр 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет,Физиолого-биохимические признаки.Оптимум роста 37,0.0,5 С, оптимумрН среды - 7,0-7,2, оптимальные усло"вия - аэробные. Активно расщепляетглюкозу с образованием кислоты и газа, а также лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, адонит, инозит, сорбит,ксилозу, рамнозу, декарбоксилируетлизин, утилизирует цитрат и малонатнатрия, обладает уреазной активностью, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Не расщепляет дульцит, не образует сероводород и индол,в реакции метил-рот отрицательна,орнитиндекарбоксилаза, аргениндегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсутствуют. Агглютинируется "К"-сывороткбй Ки К(набор К-сывороток УНИИВиС им. И.И.Мечникова).Чувствительность к антибиотикам.50 Цтамм чувствителен к неомицину, мономицину, канамицину, полимиксину, гентамицину, устойчив к стрептомицину, эритромицину, метициллину, тетрациклину, ристомицину, пенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеандомицину, линкомицину, фузидину, доксициклину. Биологические свойства. Адгезивные свойства определяли по методу Брилис ВИ. с соавт, 1) с формалинизированными эритроцитами человека 0 (1) Ю(+) группы крови, Штамм обладает свойствами адгезии средней степени: индекс адгезии - 4,48 при коэффициенте участия эритроцитов 78, средний показатель адгезии - 3,5.Вырулентные свойства 0 для белых мышей 4 млрд. м.т.В реакции агглютинации на стекле, в пробирках, планшетах в макро- и микроварианте штамм К, рпецшопдае Ю 206 не агглютинирует эритроциты человека 1, 11, 111, 1 Ч групп крови, а так же эритроциты барана, кролика, белой мыши, крысы, морской свинки, золотистого хомячка и петуха.Фимбрии штамма К. рпецгпопае206 условно названы КФА(клебсиелла, фимбрии продуцирующие адгезии 1).Штамм К. рпецтпопдае Г 206 является безжгутиковым стабильным продуцентом фимбрий - КФА.Штамм используют следующим образом.П р и м е р 1. Культуру штамма К. рпецщопдае Р 206 засевают в чашки Петри с мясо-пептонным агаром или в пробирки со скошенным агаром (рН 7,0- 7,2) и выращивают при 37+0,5 С в течение 18 ч. Одну петлю выросшей на поверхности среды культуры осторожно переносят в каплю стерильной водопроводной воды в чашке Петри и суспвндируют. Полученную взвесь наносят на предметную сетку электронного микроскопа, покрытую формваровой пленкой, обрабатывают парами Формалина, контрастируют 1,53-ным раствором молибдата аммония и исследуют в электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кв и увеличении 8000- 21000 раз. На поверхности бактвриальных клеток обнаруживают фимбрии расположенные перитрихиально,более 100 на каждой бактериальной клетке, Процент Фимбрий образующих клеток составляет 94-964.П р и м е р 2, Культуру штамма К. рпецпюпае Р 206 засевают в пробирку с 5 мл мясопептонного бульона (рН 7,0- 7,2) и выращивают при 37+0,5 С в течение 3 ч. Полученный таким образом инокулят вносят во Флаконы объемом 0,5 л со 100 мл мясопептонного77607 Стабильность продукции Фимбрий штаммом К. рпецшоп 1 ае Г 206 Дата исследования Условия хранения Голодный агар Лиафилизация М фимбрийобразующихклеток Г фимбрийобразующих клеток количество Фимбрий на 1 клетке количествофимбрий наклетке 24,08.88 11. 01. 89 19,07. 89 1 О, 01.90 96,6 96,4 96,2 96,9 96,7)100 5 17бульона. Флаконы помещают на шуттельаппарат роторного типа (60 циклов вмин, шаг платформы 45 мм) и культивируют при 37+0,5 С в течение 18 чПоокончании культивирования культуруинактивируют азидом натрия 1:10000,Далее препараты для электронно-микроскопических исследований получаютаналогично примеру 1. Количество фимбрий на каждой бактериальной клетке,расположенных перитрихиально, сос"тавляет более 100, Фимбрийобразующихклеток - 96:;,П р и м е р 3. В колбу объемом3 л, содержащую 300 мл питательнойсреды вносят 15 мл инокулята, представляющего собой смыв суточной агаровай культуры К. рпецтоп 1 ае Ю 206(5 млрд, м.т. на 1 мл). Колбу помещают на шуттель-аппарат роторного типа (60 циклов в мин, шаг платформы45 мм) и культивируют в течение 18 чпри 37+0,5 С, По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1: 10000. Препараты дляэлектронна-микроскопических исследований получают как в примере 1. Количество Фимбрийобразующих клетоксоставляет 98;, количество фимбрийна каждой клетке - более 100. Дляотделения Фимбрий от поверхностиклеток биомассу вначале осаждаютцентрифугированием . при 5000 об/минв течение 30 мин при 4 С, затем осаодок ресуспендируют в 0,05 И трис-НС 1буфере, рН 7,2 и подвергают обработке на механическом дезинтеграторе"Чхгецз" при 20000 Ррй а течение5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 в течение 30 минпри 4 С. 6Супернатант, содержащий фимбрии,подвергают исследованию в реакцияхагглютинации с антифимбриальной сы 5вороткой К, рпецщопдае КФАна стекле или в планшетах для иммунологи"ческих реакций с Ч- или Б-образнымдном, Для этого на предметное стекло наносят каплю супернатанта, суспендируют с каплей антисыворотки.При положительной реакции наблюдает .ся образование хлопьев и просветление жидкости, титр препарата 1:321: 64.,15 П Р и м е р 4, Изучение способности штамма К. рпецвопае 11 206 ста"бильно продуцировать фимбрии проводи"ли следующим образом: штамм хранятна полужидком голодном агаре под20 слоем вазелинового масла при 4 С илиофильновысушенный, через каждые6 мес, подвергают исследованию аналогично примеру 1. Как видно из данных таблицы, штаммК,рпещпопае Р 206 обладает способ"ностью стабильно продуцировать ФимбрииКФА.Таким образом, штамм К,рпещпопдае 30 Р 206 является стабильным продуцентомфимбрий КФА"1, что может быть использовано в производстве Фимбрий как ан"тигена, необходимого для полученияспецифических антисывороток и созда" З 5 нию на их основе диагностических пре"паратов.Формула изобретения Йтамм бактерий К 1 еЬз 1 е 11 а рпезпю"прае ГИСК Р 206, используемьй дляполучения Фимбрий,1777607 Продолжение таблицыаб в 4 в ю е е Дата исследования Условия хранения Голодный агар Р фимбрий- количество Ю фимбрий- количество образующих фимбрий на образуоцих фимбрий на клеток 1 клетке клеток 1 клетке 96,7. 100 100 97,6 100.ВНИИПИ Государственного комитета, по иэобретенилм и открытиям йри ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 О 1, 08,90 11.09 90 96,8 97,4 Лиофилизацияв