Штамм перевиваемых клеток -кд, используемый для вирусологических исследований

.,ЯО 1 122692 ЦС 12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Н 45207/28-13(57) ШтаНеЬа-Кдкультурдовательинфектдйлогичеси й 1 ПЕРЕВИВАЕИЫХ КЛЕТОК ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ ВИРУСОЛОИССЛЕДОВЛНИй.мм перевиваеиых клеток9 11083 (коллекция клеточныСвердловского научно-исслеского института вирусных), используемый для вирусох исследований,35 11226Изобретение относится к медицинс.кой вирусологии и представляет собой клоновьп вариант клеток эпидермоидной карциномы шейки матки человека для вирусологических исследо 5ваний.Известен штамм перевиваемых клеток НеЬа, происходящий от клетокэпидермоидной карциномы шейки маткичеловека 1 .1 ООднако этот штамм., в силу того,что его культивировали в различныхлабораториях при .различных режимахи .в различных по составу питательных средах, стал вариабельным покультуральной, морфологической, вирусологической и кариотипическойхарактеристикам,Целью изобретения является отборштамма перевиваемых клеток НеЬа,отличающийся стабильностью своихкультуральных, морфологических, вирусологических и.кариотипическиххарактеристик.Эта цель достигается использованием штамма НеЬа-КД, представляющегособой клоновый вариант клеток эпидермоидной карциномы шейки маткичеловека.Штамм НеЬа-КД получен путем одно30кратного. клонирования линии клетокэпидермоидной карциономы шейки матки человека по Паху и последующегодвукратного клонирования по У Минюв модификации Угрюмова, хранитсяв коллекции клеточных культурСвердловского НК 1 ВИ под В 110-13.Морфологические признаки, Попу -ляция клеток НеЬа-КД характеризуется однородными клетками полигональной формы с отчетливыми светлымиграницами, мелкозернистой цитоплаз- .мой и свально-круглым ядром с 2-4 мелкими ядрьппками неправильной формы,Культура в своем составе имеет незначительную долю аномальных интерфазных клеток 0,7 + 0,3% и аберрантныхформ митоза 3,8 + 0,5%, характерньпдля клоновой линии клеток НеЬа-КДявляется ограничение полиплоидностис четким выделением модального клас Оса: 50,2 + 1,8% клеток содержат 6165 хромосом.физиологические признаки. КлеткиНеЬа-КД снимают со стекла растворомВерсена щадящим способом, без центри фугирования, ресуспендируют и рассевают в культуральные матрасы в дозе50 тыс./мл или в пробирки по 92 2120 тыс,/мл. Пересевы осуществляют через 5-6 дн роста. Среда роста состоит из равных обьемов среды 199 и среды Игла с добавлением 10% нативной сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота и антибиотиков (пепициллин 100 ед/мл, стептомицин 50 ед/мл, рН 7,2-7,4.Клоновая линия НеЬа-КД отличается стабильной и более выраженной чувствительностью к респираторным и энтеральным вирусам (полио-, ЕСНО, Коксаки). Цитопатический эффект под влиянием аденовирусов проявлялся в виде набухания.и округления клеток с образованием гроздьевидных скоплений клеток, Начиная с 24 чпосле заражения размеры ядер и ядрышек увеличиваются, в ядрах появляются базофнльные пикнотические включения, которые постепенно заполняют все ядро. Процесс дегенерации клеток НеЬа-КД под воздействием аденовируса:заканчивается в течение 48-72 ч. Данные иммунофлуоресцентного анализа выявили максимальное накопление вирусснецифического антигена через 36-48 ч. Титр аденовируса в зараженной культуре 4,5- 5,33 18 ТЦЦО . Инфицирование клеток БеЬа-КД респираторно-синцитиальным вирусом штамма Лонг вызывает образование симпластов через 24- 36 ч, Полная деструкция монослоя наступает через 72-96 ч после внесения вируса. Инфекционный титр вируса составляет 4,5-5,5 1 д ТПЦ 501 гО о,гМ Содержание вирусного антигена в зара женных клетках соответствует инфекционному титру вируса.Инфекционный титр вирусов Коксаки В 1, ВЗ, В 5 на клетках .НеЬа-КДтавляет 4 5 5 ф 75 18 ТЦ 11 щ,6010,газ ф поливирусов 1, 11 и 111 типов 5,5- 7,О 1 е ТЦДдоА.Данная клеточная культура может быть использована при необходимости выделения вирусов из материалов от больных при диагностике вирусных инфекций.Для культивирования клеток исполь- зуется смесь равных количеств среды 199 и среды Игла с 10% нативной сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота. Доза клеток при посеве в культуральные матрасы составляет 50 тыс./мл, в пробирки тыс./мл. Пересев осуществляют через 5-7 сут роста.122692 Т а б л и ц а 3 Титр вируса, Тя ТЦДХарактер дегенера 0 0 Л м цииКлеточная культура 4,5+ 0,5 Специфическая через72-96 ч НеЬа-КД 3,0+0,5 НеЬа-исходная С элементами неспецифики за счет болеераннего подползаниямонослоя через 482 ч Таблица 4 Респираторно-синцитиальный вирус штамм Лонг) Аденовирус типа 7НеЬа-КЦ НеЬа-исходная НеЬа-КД НеЬа исходная 5,0 + 1,3 3,5 -. 1,4 4,6;. 1,2 8-12 15+ 0,8 20,3 + 3,0 45 - 2,8 18,3 2,8 26 эО + ЗэО 36,2 + 2,5 41,0 . 3,5 Таблица 5 ВремяпослеЧисло,клеток с аноЧисло. аномальных форм Х от общего числа деляпо фазам то хся клето аражеАнафаза Телофаза афа.за 1,8 28 1 6,31122692 Продолжение табл.5 аномалънык форм митоэа,общего числа делящихся клеток по. фазам тотическая ктивностьэ афвэа Анаафаэ ел онтро 58 + 2,553. + 2,3 22,6+2,1 2,0+0,55 55,4+0,5 5+2,+0,5 Примеч НеЬа для изучения показателевляется непригодной из-зантерфазных и делящихся клее сход я линия клет еского режим ной патологи выражток. Составитель А. Редактор И. Николайчук Техред Т.Фантаин Коррек еонтю Тираж 521 ПИ Государственного комитета СС делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раущская наб., ддписно 113035,роектная, 4 ал Времяарааеч П "Патент", г. ужгород Число клеток с анокалънвевформаминнтерфаэно -ного ядра,