Способ определения антигепариновой активности тромбоцитов

(72) Р,Э.Такташев, А,Влер и О.И.Колесникова л. М 37государственный медицин(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕ Риновой Активности ТРомБоцит Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики врожденных и приобретенных нарушений функции тромбоцитов, для выявления 4 тромбоцитэрного фактора (4 ТФ) внутрисосудистого свертывания крови и тромбообразования,Известен способ определения 4 ТФ и антигепариновой активности (АГА) тромбоцитов, основанный на учете действия прогретой, бедной тромбоцитами плазмы крови, содержащей то или иное количество термостабильного 4 ТФ, на тромбин-гепариновое время свертывания донорской бедной тромбоцитами плазмы, являющейся источником фибриногена и антитромбина, Степень укорочения тромбин-гепаринового времени свертывания служит мерилом активности 4 ТФ, Разницу определяют в секундах, она составляет от О до 5 с, в среднем 2,4 .+ 0,3 с, Аналогичное исследование проводится в плазме, полученной после АДФ-агрегации, При нормальной функцио(57) Изобретение относится к медицине, а именно к коэгулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики нарушения функций тромбоцитов. Цель - повышение чувствительности и упрощение способа. Сущность изобретения: определяют содержание гепарина в пробе до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов. Положительный зффект; при использовании изобретения позволит повысить чувствительность на 30%. нальной способности тромбоцитов разница составляет больше чем 5 с, а при тромбоцитопатиях зта разница отсутствует или слабо выражена (Лаб.дело, 1974, 1 ч. 12, с,720),Известный способ требует тестирования двух нестойких реактивов - тромбина и гепаринэ; недостаточно точная их подгонка указана самим автором, как основная причина ошибок метода. С целью контроля в способе-прототипе используется донорская плазма с возможными у различных доноров колебаниями уровней фибриногена и антитромбина, Кроме того, в плазме доноров присутствуют ингибиторы гепарина, которые, несомненно, могут искажать результаты, а выражение активности 4 ТФ и АГА в секундах не позволяет судить о конкретных цифрах нейтрализованного гепарина.Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.Поставленная цель достигается тем, что определяют содержание гепарина до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по его1767420 212 тысяч 0,08 ЕД/мл плазмы ребенок236 тысяч29%76%0,1 ЕД/мл плазмы мать304 тыс.34 о84 о/0,09 ЕД/мл плазмы разнице судят об АГА тромбоцитов и активности 4 ТФ.Использование предлагаемого способа позволяет упростить определение АГА тромбоцитов, так как не требуется многоступенчатое тестирование нестабильного по своей активности гепарина, а используется стандартный раствор фибриногена вместо субстратной донорской плазмы с непостоянным содержанием фибриногена, антитромбина, с наличием ингибиторов гепарина в ней, что существенно влияет на воспроизводимость способа-прототипа и, как следствие, делает необходимым проведение повторных исследований крови у тех же лиц с целью верификации полученных результатов, Укаэанных недостатков лишен предлагаемый способ, который, помимо всего, позволяет выразить активность 4 ТФ в конкретных цифрах нейтрализуемого им гепарина,Способ осуществляют следующим образом./У обследуемого силиконированной иглой берут кровь и смешивают ее в силиконированной пробирке с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Отбирают богатую тромбоцитами плазму и делят ее на две порции. В одной порции, богатой тромбоцитами, плазмы оп- ределяютАДФ-агрегацию тромбоцитов. После этого исследование обеих порций плазмы проводят параллельно, Богатую тромбоцитами плазму центрифугируют в пластиковых пробирках при 4000 об/мин в течение 20 мин. Берут бедную тромбоцитами плазму и прогревают на водяной бане при 56 С в течение 5 мин. После тепловой дефибринации осаждают фибриноген центрифугированием в течение 10 минут при 4000 об/мин, Надосадочный слой снимают для проведения исследования,В силиконированную пробирку набирают 0,4 мл рабочего раствора тромбина (ак-, тивностью 13 с на стандартном растворе фибриногена в 0,4 обуфере Михаэлиса), Рабочий раствор тромбина прогревают на водяной бане при 37 С в течение 2 минут и добавляют к нему 0,2 мл исследуемой дефибринированной плазмы. Сразу включают секундомер. Через 3 мин инкубации этой смеси при 37 С 0,1 мл ее переносят в проРезультаты обследования:- количество тромбоцитов- адгезия тромбоцитов- АДФ-агрегация- содержание гепарина бирку с 0,3 мл раствора фибриногена и регистрируют время свертывания, По калибровочной кривой находят процентноесодержание антитромбина.5 Во вторую пробирку перед инкубациейпри 37 С к 0,1 мл дефибринированной плазмы добавляют 0,15 мл 0,1 о -ного растворапротаминсульфата. Во второй пробе определяют процентное содержание антитромбинапо вышеприведенной методике(ТгоаЬоз.-байез Наеаозт., 1974, ч.24,М 1 - 2, рр.224 - 229). Вычисляют разность между показателями первой и второйпроб. Покалибровочной кривой находят со 15 держание гепарина в ед/мл плазмы, соответствующее разнице активности двухпроб.Определение содержания гепарина вплазме, полученной после АДФ-агрегации,проводят по методу (А,С, СССР М 1448890,01.09.88).Далее до разности в содержании гепарина до агрегации тромбоцитов и после неесудят об АГА тромбоцитов или активности25 4 ТФ, выражаемой в ЕД нейтрализованногогепарина/мл плазмы,П р и м е р 1, Б-ная С 9 лет, поступилавпервые дпя обследования. С 8 лет отмечаются носовые кровотечения, экхимозы натуловище и конечностях. Рутинная клиническая коагулограмма нарушений не выявила,Затем была обследована в лаборатории гемостаза.Результаты;- количество35 тромбоцитов- адгезия тромбоцитов 500- АДФ-агрегация 75%- содержание4 О гепарина- содержаниегепарина послеАДФ-агрегации 0,079 ЕД/мл плазмы- активность 4 ТФ 0,001 ЕД/мл плазмы.45 Предлагаемый способ позволили диагностировать тромбоцитопатию с нарушением секреции из тромбоцитов 4 ТФ,П р и м е р 2, Б-ная И., 5 лет, поступилав клинику с жалобами на частые носовые50 кровотечения, спонтанные. В семье аналогичной кровоточивостью страдает мать девочки,. 0,09 ЕД/мл плазмы 0,01 ЕД/мл плазмы 25 Диагноз: наследственная тромбоцитопатия с нарушением АГА тромбоцитов и секреции 4 ТФТаким образом, с помощью предлагаемого способа удалось не только расшифро вать генез кровоточивости, но и установить его наследственный характер, что имеет значение для эффективной диспансеризации больных с нарушениями тромбоцитарного звена гемостаза. 10П р и м е р 3. Б-ная П., 7 лет. Диагноз: Геморрагический иммунный микротромбоваскулит, кожно-суставно-абдоминальная форма, В клинической картине - типичный васкулитно-пурпурный тип кровоточивости 15 с поражением суставов, с абдоминальным синдромом.Лабораторные данные:- количество тромбоцитов 330 тысяч 20 - адгезия тромбоцитов 37%- АДФ-агрегация 147%- аутокоагуляционныйтест на 10 мин. 108%- этаноловый тест и 1- суммарная фибринолитическая активность крови 20 о- неферментативная 30 фибринолитическаяактивность крови ,4%- содержание гепарина 0,1 ЕД/млплазмы- содержание гепарина 35 после АДФ-агрегации 0,01 ЕД/млплазмы- активность 4 ТФ 0,09 ЕД/млплазмыТаким образом, по лабораторным 40 данным, выявлены гиперагрегация тромбоцитов, гиперкоагуляция, наличие в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов, выраженное угнетение неферментативной фибринолитической активности крови, ассоциирующееся с повышенным уровнем активности 4 ТФ (антигепаринового). При этом уровень гепарина в плазме крови снижен.Больной проведена базисная терапия гепарином с дотацией антитромбинаИ в виде трансфузий свежезамороженной плазмы, при этом активность 4 ТФ нормализовалась, с восстановлением до нормальных величин других показателей коагчлограммы.В данном случае предлагаемый способ позволил эффективно оценить антигепариновую активность плазмы крови, что способствовало проведению адекватной антикоагулянтной терапии.Клинические примеры подтверждают чувствител ьность предлагаемого способа, который позволяет осуществить лабораторную диагностику врожденных и .приобретенных нарушений функции тромбоцитов и выявить феномен внутрисосудистого свертывания крови и гиперкоагуляции.Метод легко воспроизводим в клинических условиях, требует значительно меньше времени на его проведение по сравнению со способом-прототипом.Результаты исследования приведены в таблице. Формула изобретения Способ определения антигепариновой активности тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы, проведение АДФ-агрегации тромбоцитов с последующим получением бестромбоцитарной цитратной плазмы, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, определяют содержание гепарина в пробе до и после АДФ-агрегации тромбоцигов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов.1767420 гб. Редактор С,Кулако изаодстаенно-издатепеский комбинат "Патент", г, Ужгород, уа,Гагарина, 10 аказ 3545 ВНИИП Составитель Г.ТюнинаТехред М.Моргентал Корректор А,Козориз Тираж Подписноедарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5