Способ антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита

(19 й 7/00 П Я ЕТ НИЕ И тения - и способа,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт эпидемиологии и микробиологии Восточно-Сибирского филиала АН СССР(56) Рубин С.Г. Вопросы серологической дифференциации арбовирусов, полиовирусов лабораторной диагностики некоторых вирусных заболеваний. Концентрация, очистка вирусных антигенов, разработка новых модификаций серологической техники. Диссерт. докт, М.: 1972.Ф Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии.В настоящее время циркулирует по крайней мере три антигенных подтипа вируса клещевого энцефалита: западный, восточный и сибирский (Айна/1448). Имеются также сообщения об обнаружении штаммов вируса клещевого энцефалита, в частности в Западной Сибири, отличающихся по анти- генным свойствам от дальневосточного и западного вариантов, что подтверждает необходимость и важность внутривидовой дифференциации штаммов.Известен способ идентификации флавирусов комплекса клещевого энцефалита путем типирования по растворимому анти- гену, Однако данным способом не осуществлялось типирование штаммов вируса клещевого энцефалита и не было разработано количественных критериев для установления степени антигенного родства испытуемых штаммов,(54) СПОСОБ АНТИГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА(57) Использование: в медицине, вирусологии, Сущность изобретения; антигенную дифференциацию штаммов вируса клещевого энцефалита проводят путем постановки реакции связывания комплемента, используя в качестве специфической сыворотки иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реакции проводят раздельно с сахарозоацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25/, и выше штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25 фД и менее - как гетерологичный прототипному, 1 табл. Наиболее близким к предлагаемому является способ внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий диффузию в геле с помощью сывороток, адсорбированных гетерологическими вирусами.Однако известный способ имеет следующие недостатки. Практика использования способа показывает, что он является трудоемким из-за необходимости получения культуральных концентрированных антигенов прототипных и испытуемых штаммов, для чего требуется большое количество дорогостоящих клеточных культур, импортных химреактивов и дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуга), Кроме того, способ менее точен из-за отсутствия количественной оценки внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита,.Цель изобре овышение точности и упрощениеЭто достигается тем, что антигенная дифференциация штаммов вируса клещевого энцефалита включает постановку иммунологической реакции специфической сыворотки к прототипному штамму с анти- геном, приготовленным из испытуемого штамма, учет результатов реакции и заключение о штаммовой принадлежности испытуемого штамма, Новым в достижении цели является то, что в качестве серологической реакции используют реакцию связываниякомплемента, в качестве специфической сыворотки используют иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозоацетоновый и растворимый антиген. При этом постановку реакции связывания комплемента проводят раздельно с сахарозоацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25 и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25 и менее - как гетерологичный прототипному.Способ осуществляется следующим образом, Суспензией мозга мышей, инфицированных прототипными штаммами вируса клещевого энцефалита Софьин (восточный подтип), А(сибирский или Айна/1448 - подтип), Преголя - 8 (западный подтип), заражают в мозг необходимое количество мышей-сосунков и через 3-4 сут проводят сбор сосунков с типичными признаками болезни, Отобранных мышей обескровливают разрезом грудной клетки, извлекают мозг и помещают в охлажденный стакан гомогенизатора тканей, К мозгу мышей добавляют охлажденный до +4"С 8,5 ф-ный раствор сахарозы из расчета 0,4 мл раствора на 1 мозг и измельчают до получения однородной массы. Ацетоновую экстракцию проводят трехкратно. используя предоварительно охлажденный до -15 С ацетон квалификации "ч". Для первой обработки берут 20-ть объемов ацетона на 1 объем вируссодержащей суспензии мозга, Суспензию осторожно, по каплям добавляют в центрифужный стакан с охлажденным ацетоном при непрерывном перемешивании, Затем взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость (ацетон), Для второй обработки берут свежую порцию ацетона в 20-кратном объеме и добавляют к осадку. Осадок тщательно разбивают фарфоровым или стеклянным пестиком до образования равномерной взвеси и выдерживают в течение 1 ч при температуре+4 С и периодическом перемешивании, Затем взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и ацетон осторожно отсасывают. При третьей обработке к полученному осадку добавляют свежую порцию ацетона в небольшом произвольном количестве, смесь тщательно перемешивают, центрифугируют, удаляют ацетон, а осадок высушивают 5 под вакуумом до превращения его в сухойрассыпчатый порошок. К порошкообразному осадку добавляют 0,1 М трис-буферный раствор до объема первоначальной суспензии мозга, Для инактивации вируса к пол ученному антигену добавляют3-пропиолактон до конечной концентрации 0,1 и выдерживают в течение 24 ч при температуре+4 С. Антиген центрифугируют на холоде (+4 С) в течение 1 ч при 15 10000 об/мин, После центрифугированияинактивация продолжается еще в течение трех суток. Контроль инактивации осуществляют заражением 5-7-граммовых белых мышей в мозг по 0,02 мл неразведенным 20 антигеном и последовательными его разведениями 10, 10 . Зараженных животных наблюдают в течение 15 суток, Стерильный 7-ный раствор бычьего альбумина на боратном буферном растворе рН 9,0 соединя ют с антигеном до конечной концентрации0,7, Приготовленный сахарозо-ацетоновый антиген делят на две части и из одной его части готовят растворимый антиген, Для этого к сахароза-ацетоновому антигену до бавляют сухую мочевину до конечной концентрации 8 М, инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего диализируют в течение 20-24 ч против 100 объемов боратного буфера рН 9,0 при 4 С для удаления 35 мочевины из препарата. У исходного саха-.разо-ацетонового антигена и полученного растворимого антигена определяют гемагглютинирующую активность (растворимый антиген не должен обладать способностью 40 агглютинировать эритроциты гуся), Затем сахарозо-ацетоновый и растворимый антигены известных и испытуемых щтаммов титруют в реакции связывания комплемента с иммунными асцитными жидкостями(сы воротками), полученными к штаммам -представителям известных антигенных подтипов вируса клещевого энцефалита.В результате перекрестного титрованияв реакции связывания комплемента сахаро зо-ацетонового и растворимого антигеновштаммов вируса клещевого энцефалита и полученных против них иммунных асцитов устанавливают, что в гомологичной системе падение титра растворимого антигена по 55 сравнению с исходным титром сахарозоацетонового антигена ни в одном случае не превышает 4-кратного, В гетерологичной системе снижение титра растворимого антигена по отношению к исходному титру сахарозо-ацетонового антигена отмечено в1735362 55 интервале 4-32 раза(25-3,1 ). Исходя из этих данных, устанавливают количественные критерии антигенной квалификации того или иного штамма (т.е. при значении 25 и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при значении 6,25/, и менее - как антигенно отличный от прототипного).П р и м е р, Для исследования выбирают штаммы Софьин, А- клон штамма Айна/1448, Тенис, Бузуучук, Нугуш, 4072, Преголяи Скалица, Приготовляют сахароза-ацетоновый и растворимый антигены по вышеописанной методике. Против указанных штаммов получают иммунные асцитные жидкости (ИАЖ), которые используют для перекрестного титрования сахарозо-ацетонового и растворимого антигенов в реакции связывания комплемента (РСК).Результаты исследования представлены в таблице,Как видно из данных таблицы, при использовании сахарозо-ацетонового антигена (САЛ) разница в титрах с гомологичной и гетерологичными ИАЖ, как правило, не превышает двукратной, и в случае растворимого антигена (РА) - достигла 32 раз, В то же время отмечают, что в гомологичной системе титр РА постоянно снижается не более, чем в 4 раза, по сравнению с титром исходного САА, из которого данный РА получают, В реакции с ИАЖ к другим антигенным подтипам разница в титрах САА и РА одного и того же штамма стабильно составляет 16 и более раз. РА штаммов вируса КЭ не реагирует с ИАЖ к вирусам ОГЛ и Повассан. Зти наблюдения позволяют установить количественные критерии дифференциации штаммов вируса КЭ, Уровень антигенного родства штаммов таким образом может быть выраТит РАжен формулой Ндг = Т САА100,Изданныхтаблицы следует,что при Ндг 25 фштаммы, использованные для получения антигенов и антител, антигенно родственны, а при Ндг6,25 ф - относятся к разным антигенным подтипам,Анализ полученных данных в отношении 8-ми штаммов вируса КЭ показывает. что помимо представителей трех антигенных подтипов вируса КЗ (Софьин - дальневосточный подтип, А- сибирский или Айна/1448 - подтип и Преголя- западный подтип), выявляются еще две антигенные группы. Одна из них представлена штамма ми Нугуш и 4072, другая штаммом Бузуучук.Кроме того, имеются штаммы, обладающие антигенным родством с представителями двух разных вариантов. Таковы штаммы Тенис и Скалица. Полученные данные иллюст рируют более высокую точностьпредлагаемого способа, а также его широкие воэможности для антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита.15 В целом вопрос об антигенной вариабельности вируса КЭ до настоящего времени не является достаточно ясным и требует скорейшего разрешения, С ним, в частности, связано адекватное решение проблем 20 лабораторной диагностики, специфическойпрофилактики и терапии КЭ, Изучение этого вопроса также важно для познания и прогнозирования процессов изменчивости вируса, особенно в связи с возрастающими 25 масштабами и темпами антропогенноговоздействия на природные очаги КЭ. Формула изобретения Способ антигенной дифференциации 30 штаммов вируса клещевого энцефалита,включающий постановку иммунологической реакции специфической сыворотки к прототипному штамму с антигеном, приготовленным из испытуемого штамма, учет 35 результатов реакции и заключение о штаммовой принадлежности испытуемого штамма, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве серологической реакции исполь зуют реакцию связывания комплемента, вкачестве специфической сыворотки - иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реак ции связывания комплемента проводятраздельно с сахарозо-ацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25 фи более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 50 6,25 и менее - как гетерологичный прототипному, 1735362