Штамм вируса гриппа аяпония157(h2n1) для моделирования инфекции у мышей

(51) ТЕН Б САНИЕ И ОРСКОМУ СВ ЕЛЬСТВУ К ония Я ИН русолотальной обретея/ 1/57 аться в тальную ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Правдина Н,ф Подчерняева Р,ЯСковородка В.В. и др, Активность вирионной РНК-полимеразы у вариантов вируса гриппа А и В, различающихся по признаку патогенности для мышей. - Вопросы вирусологии, 1986, М 12, с. 29-33.ЧегПг 1 ег .1.1 ., АПзоп А.СЯсЬб С.С, 1 гпгпопе гезропзез топ 11 цема 1 п тле топазе апб 11 ег сопсго о 1 йе 1 п 1 ессоп, Вгтз 1. Мебса 1 ВоПе 1 и, 1979, У. 35, р. 65-68,Изобретение относится к медицинскои вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А человека, адаптированный к размножению в легких мышей.Предлагаемый штамм пригоден для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции, что позволит определить протективные свойства вирусов с разной антигенной формулой и проводить скрининг химиопрепаратов,Эпидемическое распространение гриппа во всем мире и экономические потери, связанные с временной нетрудоспособностью, выдвигают проблему гриппа в число важнейших. Трудность ее практического решения - отсутствие достаточно эффективных средств специфической вакцино- и химиопрофилактики, что в значительной мере обусловлено высокой вариабельностью вирусов гриппа, Действие антивирусного химиопрепарата должно быть направлено не только на определенный этап вирусной(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А /Я 1/57 (Н 2 М 1) ДЛЯ МОДЕЛИРОВАН ФЕКЦИИ У МЫШЕЙ(57) Использование; медицинская ви гия для моделирования эксперимен гриппозной инфекции. Сущность из ния: штамм вируса гриппа А /Япони (Н 2 И 1). Штамм способен размнож легких мышей, вызывать у них ле пневмонию и относится к антигенно типу гемагглютинина (Н 2) 3 табл,инфекции, но онодолкно быть нетоксичнымна всех уровнях его изучения и использования. До момента внедрения научных результатов в клиническую практику необходимо проведение опытов по отбору кандидатов в вакцинные штаммы и скрининг химиопрепаратов. Для.этих целей необходимы чувствительные к гриппозной инфекции экспериментальные лабораторные модели и вирусы гриппа, способные размножаться в организме восприимчивого хозяина. Широкое практическое использование мышей, их низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более редких и дорогих животных, например хорьков, обезьян. Поражения легких, вызываемые вирусом гриппа у мышей, представляют собой вирусную пневмонию, похожую во многих отношениях на вирусную пневмонию у человека. Необходимо отме 1735363тить, что в естественных условиях мыши резистентны к инфицированию вирусами гриппа.В настоящее время известны штаммы вируса гриппа А, вызывающие летальную пневмонию у мышей - А/ЮЯК /33/ (Н 1 К 1), А/РВ/8/34 (Н 181), А/СССР/90/77 (Н 181), А/АсЬ/2/68 (НЗМ 2). Наиболее известным является штамм А/АсЫ/2/68, прошедший более 100 пассажей через легкие мышей и обладающий высокой пневмовирулентностью, Вирулентные для мышей штаммы используются как для решения задач практического здравоохранения (определение протективных свойств при отборе кандидатов в вакцинные штаммы, изучение активности химиопрепаратов), так и в научных исследованиях.Указанные аналоги представляют собой штаммы вируса гриппа А с гемагглютинином подтипа Н 1 или НЗ. Заявляемый штамм А /Япония/1/57 (Н 2 К 1) сходен с вышеперечисленными аналогами по существу, но представляет собой новый в антигенном отношении вариант. Штамм относится к вирусам гриппа А с гемагглютинином подтипа Н 2, К преимуществам данного рекомбинантного штамма относится наличие в его составе нейраминидазы Й 1, что отличает его от других штаммов с гемагглютинином подтипа Н 2 и позволяет устранить влияние антинейраминидазных антител на результаты опытов по выявлению протективных свойств этих штаммов,Цель изобретения - получение вирулентного для мышей штамма вируса гриппа, пригодного для моделирования экспериментальной инфекции,История получения штамма.Штамм получен в результате 22 последовательных пассажей через легкие белых мышей массой 6-8 г при интраназальном заражении. При первичном инфицировании в качестве исходного материала использовали неразведенную аллантоисную жидкость, в дальнейших пассажах - 10 -ную суспензию легких белых мышей, забитых через 48 ч после заражения.Предлагаемый штамм обладает всеми признаками и характеристиками вируса гриппа А и хранится в коллекции лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР (кодовый номер ГКВ 2336), Штамм характеризуется следующими морфологическими, биологическими и антигенными свойствами,Морфологические признаки. При негативном контрастировании в популяции содержатся вирионы гриппа стандартной10 15 сферической формы со средним диаметром 80-120 мм (75,0). Имеются также каплеобразные формы (24,0 ), большие сферы (1,0 ), Следует отметить, что при исследовании 200 частиц в популяции адаптированного к мышам штамма А /Япония/ 1/57(Н 2 М 1) по сравнению с исходным отмечено увеличение каплеобразных и больших сферических форм с 1,5 до 25,0(табл. 1),Биологические свойства. Исходный вариант не размножался в легких белых мышей, Однако в ходе пассирования происходит селекция мутантов, приобретших способность размножаться в организме другого хозяина (мыши), при этом наблюдается изменение инфекционной активности, гемагглютинирующих свойств.Инфекционная активность адаптированного штамма - 7,71 ц ЭИД 50/0,2 мл,Антигенные свойства, По антигенной композиции гемаггл ютин ин а (оп ределяемой в РТГА с поликлональными крысиными сыворотками) адаптированный штамм не 20 отличается от исходного (табл, 2). Отмечены25 различия в способности связываться с моноклональными антителами й 1, М 185, К342 к гемагглютинину Н 2. Показана большая реактивность вирулентного для мышей. штамма А /Япония/ 1/57 взаимодействовать30 с моноклональными антителами к М-белку,наибольшие различия установлены для 3 антигенного сайта (табл, 3),Иммуногенные свойства. Предлагаемый штамм обладает способностью более ак 35 тивно вырабатывать антитела у мышей посравнению с исходными авирулентнымидля мышей штаммами вируса гриппа.Патогенность для мышей. Адаптированный вирус вызывает выраженные патологи 40 ческие изменения в легких, а также гибельмышей в течение 10,ут наблюдения, 50 фгибели животных отмечено при интраназальном введении 50 мкл вируса в разведении 105,1, т.е.1 ц ЛЦ 50 = 5,1, Вирулентность45 адаптированного к мышам штамма равна1,5.Физико-химические свойства. При исследовании электрофоретической подвижности белков в ПАГе отмечены минорные50 вариации для НА- и КР-белков у адаптированного штамма по сравнению с исходным.Предлагаемый штамм предлагается использовать для изучения проективныхсвойств штаммов вируса гриппа А с гемагг 55 лютинином подтипа Н 2 как человеческого,так и животного происхождения, После иммунизации мышей инактивированнымипрепаратами вируса интраназально вводятадаптированный штамм А /Япония/ 1/57 иопределяют уровень защиты.1735363 Таблица 1 Вирулентность для мышей 19 ЛД 5 оИнфекци онная ак-тивность1 д ЭИДьо каплеоб- гигантразные ские филаментозные сферические98.5 2.0 Нет 0,5 7,7 75 40 45 Таким образом, предлагаемый штамм А /Япония/ 1/57 сходен по способу получения с другими вирулентными для мышей штаммами, однако обладает важной особенностью - он относится к другому анти генному подтипу гемагглютинина (Н 2), Эта особенность, наряду с достаточно высоким показателем ЛДбо, является основным преимуществом заявляемого штамма, Использование предлагаемого штамма позволит 10 изучать перекрестные протективные свойства вирусов, относящихся к Н 2-подтипу гемагглютинина. Адаптированный к мышам штамм А /Япония/ 1/57 наряду с вирусами гриппа А с гемагглютинином Н 1 и НЗ может 15 быть использован для изучения действия различных химиопрепаратов в опытах с экспериментальной гриппозной инфекцией.П р и м е р, Моделирование экспериметальной гриппозной инфекции у мышей. 20Для оценки протективных свойств различных штаммов вирусов гриппа А с гемагглютинином подтипа Н 2. изолированных от человека и птиц, был использован предлагаеимый адаптированный к мышам штамм ви руса гриппа А /Япония/ 1/57 (Н 2 М 1),Мышей Р(ОЮВ) массой 6-8 г (в каждой группе по 25 шт.) иммунизировали инактивированными ф-пропиолактоном (0,015 М конечная концентрация) препаратами виру сов гриппа А (Н 2), В работе использовали следующие штаммы; А /Япония/ 1/57 (Н 2 М 1), А /Ленинград/ 1468/65 (Н 2 М 2), А /Токио/ 3/67 (Н 2 М 2), А /утка/ /Германия/ 1215/73 (Н 2 КЗ), А /утка/ Нью-Йорк / 35 6686/78 (Н 2 МЗ), А /шилохвость/ Альберта/ 211/80 (Н 2 ИЗ), А /чайка-хохотун/ НьюДжерси/ 75/85 (Н 2 й 9). Для каждого п репарата определяли дозу =20 мкг белка/мышь, гемагглютинирующую и инфекционную активности (до обработки Р-пропиолактоном). Через 21 день после предварительного определения титра антител в сыворотках животных каждой группы под легким эфирным наркозом мышам интраназально вводили по 50 мкл патогенного для них штамма вируса гриппа А /Япония/ 1/57 в дозе 3 ЛДы. Гибель мышей регистрировали в течение 10 дн, после заражения, затем высчитывали % выживаемости животных. В контрольной группе животных (получавших плацебо-р-р БСА на физиологическом растворе) гибель животных составляла 100%, В остальных группах эти показатели колебались от 0% до 58,0%,Сравнительный анализ полученных данных о степени защиты экспериментальных животных, получавших препараты различных вирусов гриппа А (Н 2), позволяет судить о перекрестных протективных свойствах вирусов, Суммарный анализ этих результатов, а также данных об антигенной специфичности поверхностных белков, позволяет судить о возможности внедрения в человеческую популяцию вирусов гриппа А (Н 2) птиц, продолжающих изолироваться и в современных условиях,Формула изобретения йтамм вируса гриппа А /Япония/ 1/57(Н 2 К 1) ГКВ 2336 для моделирования вирусной инфекции у мышей. Мо ология ви ионов,1735363Таблица 2Таблиц.а 3 10 15 20 25 Составитель Ю. Смирнов Редактор Н. Гунько Техред М. Моргентал Корректор Т. Малец Заказ 1793 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101