Способ определения содержания белка в дрожжевых клетках

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1725121 193.Я Ця)ю 8 ЗЗ 48,С 12 О 1 МИТЕТТКРЫТИЯМ ОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ОБР ЕЛЬС К АВТОРСКОМУ СВ ствляют следуробу клетокя, дезинтегры путем 4-6 мдетергентови 0,03-0,04 ма Способ осущ микроби о для кон клетках ом культ обраоло тро зом.Отбирают п культивировани точные мембран ции со смесью тритона Х = 100 из среды руют клеин инкуба,02 об.т с, цетилп,ри ивиние тся уска.(71) Институт фотобиологии АН БССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ(57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для контроля за содержанием белка при лабораторноми промышленном культивировании дрожжевых клеток, С целью ускорения и повышенияточности способа из дрожжевой суспенэииотбирают пробу, содержащую 0,9-1,5 мг биомассы, инкубируют се со смесью детергенИзобретение относится к гии и может быть использован ля за содержанием белка в лабораторном и промышленн ровании дрожжевых клеток,Целью изобретения являе и повышение точности способ тов, лизирующей клеточные мембраны, осаждают белок и клетки раствором 10 ф- ной трихлоруксусной кислоты и М 9504,осадок ресуспендируют в новом растворе и проводят реакцию с люминесцентным реагентом на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид). При проведении реакции с флуорескамином или ортофталевым альдегидом строят две калибровочные кривые, одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе, а другая - от количества биомассы в пробе, и определяют предельно допустимые концентрации белка и.биомассы по мЕньшему из двух. предельных значений флуоресценции, а концентрацию Сд, мг/л, дрожжевого белка рассчитывают по формуле Сб =С ст +К, где Сст - максимальнаяРх Ео,Ест оконцентрация стандартного раствора бел- ф ка; Ест, Ео, Ех - интенсивность флуоресценции контрольной, стандартной иаааа измеряемой проб соответственно; 1 - фактор разведения - объем ресуспендированного осадкаl объем исходной пробы; К - ЬсЭ пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка. 1 з,п.ф-лы. 1 ил.10 15 20 25 30 35 40 считывают по формуле 50 триметиламмоний бромида, осаждают дезинтегрированные клетки в течение 10-15 мин инкубации с раствором 10 мас,Я трихлоруксусной кислоты и 5,0-7,5 мас. М 9304 7 Н 20, центрифугируют, отделяют супернатант и разводят осадок буферным раствором, К ресуспендированному осадку добавляют флуоресцентный реагент на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид), проводят его реакцию с белком и измеряют интенсивность флуоресценции продуктов реакции (Е).На чертеже показаны кривые, характеризующие предлагаемый способ.Для определения концентрации белка в . пробе строят две калибровочные кривые (см, чертеж ), одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка, а другая - от количества биомассы а пробе. По наименьшему из двух предельных значений флуоресценции (ЕпреД, выше которых нарушается линейная зависимость Е от концентрации белка, устанавливают диапазон измеряемых концентраций белка и биомассы, Настраивают чувствительность флуориметра на Ест = 100 О по пробе с максимальной допустимой концентрацией стандартного белка (Ест = Епред), измеряют интенсивность . флуоресценции исследуемой пробы и рассчитывают концентрацию (мг/мл) дрожжевого белка Сб по формулеЕх - Ро, .Сб Сст - -р-ГКЕст огде Сст - максимальная концентрация стандартного раствора белка;Ест, Ео, Ех - интенсивности флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно;1 - фактор разведения - объем ресуспендированного осадка / объем исходной пробы;К- пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка,Кроме того, при проведении реакции дрожжевого белка с флуорескамином с целью повышения чувствительности способа пробу дрожжевых клеток готовят в боратном буфере с рН 9,45 - 9,55. П р и м е р 1. Для определения белка в дрожжевых клетках Слаоза, культивируемых на н-парафинах. по реакции с флуорескамином в предварительных опытах измеряют при фиксированной чувствительности флуориметра зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации в пробе дрожжевой биомассы и от концентрации стандартного белка (БСА). Устанавливают, что раньше (при Е Е) нарушается линейность сигнала для концентрации БСА, По найденной величине Ем определяют предельную концентрацию биомассы в пробе С 1 м -0,63 мг/мл и максимальную концентрацию стандартного раствора БСА С 2 м = -025 мг/мл. Затем в специальной серии 10- 20 проб параллельно проводят определение белка предлагаемым методом и методом Кьельдаля и вычисляют пересчетный козффициент К = 1,48.Далее способ осуществляют следующим образом. Отбирают 0,1 мл дрожжевой суспензии, взятой из 12-й секции промышленного ферментера и содержащей 19-24 мг/мл биомассы. Добавляют к ней 1 мл лизирующего реагента В 1, пермешивают и инкубируют 2 - 3 мин, Затем добавляют 1 мл осаждающего реагента В 2, инкубируют 10 мин, центрифугируют 10 мин при 4 тыс об/мин. Полученный супернатант сливают и осадок ресуспендируют в 5 мл боратного буфера (0,1 М, рН 9,5).Таким образом, фактор разведения исходной ДС 1 = 5 мл/0,1 мл = 50, что соответствует конечной концентрации биомассы Скон = Сисх/1 = 0,38 - 0,48 мг/мл и не превышает предельной концентрации С 1 м = 0,63 мгlмл.Теперь берут 0,5 мл ресуспендированного осадка, добавляют 0,2 мл люминесцентного реагента Вз с ФАМ, быстро перемешивают, инкубируют 4-5 мин и добавляют 3 мл боратного буфера (0,1 М, рН 9,5),Перед измерением флуоресценции проводят настройку чувствительности флуориметра "Квант" (Е = 100%) по пробе со стандартным раствором БСА(+ 0,2 мл В 5 мин инкубации + 3 мл боратного буфера) Затем измеряют интенсивность флуоресценции в исследуемой пробе, при Явоэб=400 нм и Лисп= 480 нм Ех = 65. Также измеряют интенсивность флуоресценции контрольной пробы, Ео = 5. Содержание белка а исходной ДС расСдБ (Рх-Ро)+ К = 11, 68 мг/мл .Ест- оПроцентное содержание белка в клетках определяют по формуле С Б ммл 11,68 П р и м е р 2, Для определения белка в дрожжевых С.еайоза, культивируемых на н-парафинах, по реакции с ортофталевым альдегидом, так же как в примере 1, вначале измеряют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации дрожжевой биомассы и от концентрации стандартного белка(БСА), Устанавливают, что раньше при Г Гм нарушается линейность сигнала для концентрации биомассы. По величине Ем 5 определяют предельную концентрацию биомассы в пробе С 1 м = 6 мг/мл и максимальную концентрацию стандартного белка С 2 М,5 мг/мл. Затем определяют пересчетный коэффициент от концентрации БСА к концентрации дрожжевого белка К = 1,78. После этого проводят определение белка в исследуемой пробе, взятой из 12-й секции 10 промышленного ферментера, К 0,1 мл пробы добавляют 1 мл лизирующего реагента В 1, инкубируют 2 - 3 мин, добавляют 1 мл осаждающего реагента 82, инкубируют 10 мин и центрифугируют образец в течение 10 мин при 4 тыс, об/мин. Супернатант сливают, а остаток растворяют в 200,6 мл 0,1 М ВаОН. Это соответствует разведению исходной суспензии в 6 раз(1 = 0,6 мл/0,1 мл = 6). При исходной концентрации биомассы Схл = 20 мг/мл конечная концентрация в разведенной пробе составляет С хонвч = 3,3 мг/мл и лежит в середине линейного диапазона концентрированной зависимости Е от Скл 25 45 также интенсивность флуоресценции контрольной пробы Ео = 10. Подставляют полученное значение интенсивности флуоресценции исследуемой пробы Ех = 78 и другие измеренные показатели в формулу и рассчитывают весовое содержание белка СдБ-(78 - 10) 61,78 =12,1 мг/Мл,1,5100 - 10Процентное содержание белка в биомассе определяют по фромулеСДБС Б ммл12, 1/20 = 61 мас .м млТаким образом, в разработанном способе предложены менее трудоемкие и более эффективные операции дезинтеграции 30Затем проводят реакцию с ортофталевым альдегидом. Перед опытом к люминесцентному реагенту Вз добавляют 10 мл дитиотреитола (на 10 мл Рз 0,5 мл, 30 мг/мл дитиотреитола в этаноле). Далее к 0,1 мл 35 ресуспендированного осадка добавляют 1 мл реагентав йз, инкубируют 10 мин, добавляют 3 мл 0,5 М 1 чаОН, инкубируют еще 10 мин и измеряют интенсивность флуоресценции Мвозб = 365 нм, Асо= 440 нм) на 40 флуориметре "Квант", предварительно на- страивают чувствительность флуориметра (Е = 100;) по пробе со стандартным раствором БСА Сот = С 2 м = 1,5 мг/мл, Измеряютдрожжевых Клеток и их о;аждения, Повыше. на точность определения концентрации белка за счет предварительной оценки линейной зависимости флуоресценции от концентрации стандартного белка и биомассы, установления наименьшего из двух пре дельных значений флуоресценций, по которому настраивают чувствительность прибора, а также определения пересчетного коэффициента К, учитывающего видоспецифичность флуоресцентного сигнала для различных белков, Формула изобретения 1. Способ определения содержания белка в дрожжевыхклетках. включающий дезинтеграцию клеток, осаждение белка раствором трихлоруксусной кислоты, проведение реакции белка с флуорескамином или ортофталевым альдегидом и определение содержания белка в пробе по флуоресценции продуктов реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, дезинтеграцию клеток проводят путем их обработки в течение 4 - 6 мин смесью Тритона Хв концентрации 0,02 об.оь и цетилтриметиламмоний бромида в концентрации 0,03-0,04 мас.6, осаждение белка ведут в течение 10-15 мин, при этом к раствору трихлоруксусной кислоты добавляют МЯЯО 4 7 Н 20 в концентрации 5,0-7,5 мас.о, при проведении реакции с флуорескамином или ортофталевым альдегидом строят две калибровочные кривые; одна из которых отражает зависимость интенсивности Флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе, а другая - от количества биомассы в пробе, и определяют концентрации белка и биомассы по меньшему из двух предельных значений флуоресценции, а концентрацию Сб, мг/л, дрожжевого белка рассчитывают по формулеСб =Сс где Сс - максимальная концентрация стандартного раствора белка;Гст, Ео, Ех - интенсивности флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно;5 - Фактор разведения - объем ресуспендированного осадка/объем исходной пробы;К - пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка.1725121 2, Способ поп.1, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительно, сти способа при проведении реакции дрож 80 60 4 0,2 С З С и/ид Составитель Р.АдзериТехред М.Моргентал Корректор О.Ц едактор И.Горная Заказ 1172 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 10 Р 100жевого белка с флуорескамином, пробудрожжевых клеток готовят в боратном буфере с рН 9,45-9,55.