Способ получения антисыворотки к -эндотоксину н1 вас. тнuringiеnsis

СОЮЗ СОВЕТСНИХР)ЦИАЛИСТИЕСН)1РЕСПУБЛИК 119) 111 1)5 А 61 К 39/О САНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЕЛЬСТИ 1, Бил 07.09 42905 27.07 Всесо инсти.87юэный нтут при но-иссладной ми довательробиолоА.Л.Андре 8)1, Арр 1 а 1978, 36,Л.В.Кузина и 612.015 (088 Апя В.1. еСМдсгоЬдо 1, -626. Й ЕпчдР 4,защиты растений тивного средства дл от вредных насекомь д 11 ця гЬцядя 2-8 потамма В.гЬцядя 202 нош штамм Ваг.гЬцгдпддеой клетокг. гЬцгдп 8 де орогенн гдп 8 депядя ча лучен обработкгдпядепядз ча ическим ингиб вобиоциномтором ДЕЕК-аэыПредлагаемзуется следуюШтамм ВасдгЬцгдп 8 депздвкультура длявышения выходческого белка-8 " аспо прощения с и чистоты для получе ндотоксину исталлив антис раиитГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЬВОРОТКИ К 13-ЭНДОТОКСИЕЕУ Н 1 ВАС.ТЕШК 1 гЕС ЕКБ 1 Б (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к промышленному производству препаратов для количественного и качественного определения кристаллического белка -эндотоксина. Целью изобретения является упрощение способа, повышение выхода и чистоты антигена для получения антисыворотки к Р -эндотоксину Н 1. Для этого испольИзобретение относится к промышлен ной микробиологии и касается аспорогенного штамма Вас.гЬцгдпцдепздз ча гЬцгдпддепядв 2-8, используемого для получения антисыворотки к Р -эндотоксину Н 1.Цель изобретения - упрособа, повышение выхода и чантигена для получения антисыворогки к 3 -эндотоксину Н 1.Поставленная цель достигается использованием аспорогенного штамма Васд 11 цв СЬцгдпядепядя чаг,гЬцгдпддепз да 2-8. 2эован аспорогенный штамм Вас.гЬцгдп 8 депздв чаг.гЬцгдщдепздя 2-8. Прово двт выращивание культуры укаэанного г)тамма, смывание ее физиологическим раствором, центрифугирование и растворение полученного антигена в натрий-карбонатиом буфере и 10 мМ дитио трейтоле при рН 10,0, последующую иммунизацию кролика, забор крови и очистку антисыворотки. Способ позволяет упростить получение антисыворотки к Д -эидотоксину, повысить выход укаэанного антигеиа до 99 Х по сравнению с прототипом (20-30 К), обеспечивает чистоту антигена - полное отсутствие спор, тогда как у прототипа от 3 до 10; спор, Изобретение может быть использовано в производстве средств контроля /3 -эндотоксина Вас.ГЬцгдп 8 депядя -эффек 1 97799с,"у1 ", 3. е Экмикр з 1 дцизмо В 111 г и. ткд, косцекциоциый омер В,1 орс 1 иессие цри:инки,5Подвижна грдмпслжительцая пдочка. Рдзм.р(1, -1,81 Х (3, 4 "4, 5) мкм.Марфологической особенно.тью является отсутствие спср и абраовацие одного-двух кристаллов н одной клетке,Кристалль ромбовидной формы с четкиии грдняиио РЗмср кристалОУ . О.;х 1,5 мкм.Проверка щтдммд В, 1:1 гцгз.п 1,. епвачаг.гГцг 1.п 1 гепэгэ 2-8 по Н-антигецусо специфической сьпзороткой подтвердила принадлежность полученного мутанта к подвиду ьсггпу.епвгв. Микроскопия клеток штамма В. Г 1 щгпрз.епзгвчаг. 11 гцгпрзепяв 2-8 с помощью фазовокоцтрастцой микроскопии, а такжерезультаты микроскопии ультратонкихсрезов подтвердили отс.угствие спорв клетках и в свободном состоянии.Культурдлыые и физиологические 25признаки.Хорошо растет нд полноценных питательных средах (мясопептонцом дгаре и бульоне, дгдре из рыбного гидролиэата, агаре ца перевдре Хоттинге- ЗОра). Оптщаьцой средой для синтезакристаллов является картофельныйагар: 600 г картофеля и 1 г 11 аС 1 на1 л воды. На твердых средах образуетсероватые колонии. Пигмент не выделяет. Поверхность с.гховатая, Суспензия клеток в воде равномерная. Вжцких питательных органических иминимальных солевых средах наблюдается помутнение и образование пленкии рьхлого осадка. Картофель ломтиками, рост обильный, с.еро-кремоные колонии, Гигмент це образует.Молочный агар. Пептоцизация чаСтичная, Белточ.й дгдрРост умерец 45ньЬ, лицетин усваивается слабо.Отношение к источникам углерода.Использует глюкозу, сахарозу, манноэу, иальтозу, кукурузный и картофельный крахидл, Не усваивает манноэу,сорбит, лактозу, ксилозу.факультативцый азроб, Оптимдль"ная температура раста 2 ЯС. Опти 6мум рН 7,0-7,4,П р и и е р 1. Способ полученияаспорогеццого штамма Р.гЬиг 11.епвв 55чаг.гЬцггпддепз.в 2-8,еДля получения дспорсгецного мутанта штамма В, Огцгтпр 1 епя 1.в 02 клетки, ш . ни мас -иоцбу иа ло плотностив10 с/1вносии нонобиоцин дс кон цтрц 5 мгс/." и выращивали 4 с чпри 30 С на кдчд.ке 2 О об/мцц, Развед-.ция ку:туры нь:енд нд мясспептоццый дгдр (М 11 Л) и отдельные колонии дцдли.ирс)вали с помощьк фаэовокоцтрдстцой микроскопиии на присутствие н клетках спор и кристаллов. БактсГ)илл) сло в клетках которогоо гсутс:т нондли сор , был отобран длядальнейших исследондций,Для проверки на присутствие у отобранного клона, получившего бозндчение В ь 1 цгп 11 гепв 1.в 2-8 клеток, содержащих споры, этот клан ныращиналив лрожжеполисахдридцой среде в течение 72 ч при 30 С, прогревали при 70" С20 мин (эту температуру выдерживаюттолько споры) и высевали ца МПА.Появлсцие роста це ндблюдалось, чтодока.ывало 1007,-цую асцорогецностьполученного мутанта. Полученный мутант В. .1 иг 1 п 1;.епз.з чаг. 1 игдп 1,.епязз 2-8 стабильно сохранял свойство аспорогенцости при псресевдх.Поддерживает я ри храпниц н нидевегататинных клеток нд среде МГАриО6 С в течеие двух лет.П р и и е р 2. Для получения антисывороткц к (3-эндотоксицу Н 1 аспорогеццый штамм В.ьЬцггп 81.епэ 1.я 2-8 выращивдли на картофельном агдре в течеце 5 дней. Биомассу смынали с агара раствсром 0,857.-ного хлористогонатрия и осаждали центрифугированиемпри 4000 об/мин в течение 10-15 мин.Осадок ресуспецдировали в 0,05 М натрий-карбондтном буфере (рН 9,5) и10 иМ дитиотрейтоле и оставляли наО2 ч при 20 С, После выдерживация цецтрифугировдли при 6000 об/мин 15 мин.Полученный супернатант содержал чистый препарат растворенных кристалловв концентрации 2,16 иг/мл.Для иммунизации 2 кроликов испольэовали 1 мл раствора кристаллического белка в концентрации 1 мг/мл,Иммунизацию проводили по описаннойранее методике. Полученная дцтисыворотка имела титр 1:16. Антисывороткабыла использована для определенияантигена прн анализе бактеридльцыхклонов, содержащих рекомбинацтнуюДНК,в составе которой находятся деневтические детерминанты синтеза /3 в зндотоксина Н 1. Полученную ацтнсыворотку14977 сутствуют стадия 1 тлс ццярц:талформула изобретения Составитель А.МакаровТехред Л,Олийнык Корректор Н.Король Редактор ЛЛавлова Тцаж Заказ 3723 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская цаб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.укгоцц,6.ио. зовцли цля к.гцеств цц 1 г 1 определения- цдотоксццл в претвратах битоксибациллина, иолу ецпго цаоснове промьипленцого продуцецтаВ, гЬиг 1 п 81 епз 1 з маг, г 1 гцг 1 щз.ц 1 э 1 я5620 М, используя известные цммунохимические методы,П р и м е р 3. Для получения ацтисыворотки К Р -эндотоксину Н 1 штаммВ.гЬцг 1 п 81 епв 1 з 2-8 выращивали, какописано вьппе (пример 2). Биомассусмывали раствором 0,857-ного НаС 1и осаждали центрифугированием 1520 мин при 4000 об/мин. Ресуспендировали осадок в 0,05 М натрий-карбонатном буфере (рН 10,5) и 10 мМдитиотрейтоле, Далее процедура неотличалась от описанной в примере 2,Результаты, полученные в пгмре 3,не отличались от результатов примера 2. Таким образом, описаццый способ позволяет упростить пргц,сгуру получе ния антисыворотки к 3-зцлстоксину, повысить выход антигеца дп 997 по сравнению с прототипом (20-30 Х), его чистотъ - пл,)тутт)р, тогда какцр:т.цц т 1 л .", ц 1 р, так как в прели мгиц 1 м .ц г и отлов от спор ц посл ц, 1 ц 1 ткв от сцороцых белков, чт л 1 г-ц т я ис"- пользованием асцорогеццого таилв В, с Ьцг 1 п 8 гет.э 1 в наг. гЬг 2 ц;г пв 1 я 2-8,Способ получения ацтисыворотки к 3-эндотоксину Н 1 Вас.1.Ь 1 г 11 с 1 епя 1 з, включающий выращивание культуры бактерий Вас.гциг 1 пд 1 епв 1 з, смьцание ее физиологическим раствором цецтрифугирование и растворение полученного антигена в натрий-карбонатцом буфере и 10 мМ дитиотрейтоле при рН 10,0 с последующей иммунизацией кролика, забором крови и очисткой ацтисывороткц, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода антигена, в качестве выращиваемой культуры Вас.Юцг 1 пдгепв 1 а используют штамм Бас,СЬиг 1 пргепздв 202-2-8 У ВКПМ В.