Способ получения антигенных детерминант vp -белка fmd вируса субтипа о к

(5) 5 ОПИСАНК ПАТЕНТУ ОБР Е 25 мпани (ОЯ)Димарчи и Дже ьд 83. и, 1983, ч. 99 носится к биотехноло пользовано для получе етерминант ЧР белка щуром являе водящим к, которое дставляюще ства пикор ия антигенн предполагаеептидов р (141 - 158) ро-Сер (14 с(Ар г-Ти р-А -Про-Протетических вакцин проиды синтезируют с поазного пептидного ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Эли Лилли энд К(72) Ричард ДэннисСтивен Брук (ОЯ)(56) ЕР М 0090581,кл, А 61 К 39/135, 19СЬеп)са АЬзтга26, р. 442. Изобретение отгии и может быть исния антигенных двируса ящура.Заболевание яинфекционным, принию заболеваниемвирусом ящура, прерус животных семейСпособ полученнант вируса ящураный синтез и, Получение синтив ЭНР, Все пептмощью теердоф тся высоко- обессиливавызывается го собой вин ави русов.ых детермит твердофазЦис-Цис Про-Цис-Гли 1 - 158)-Про- сп-Арг-АспТре(Глу-Ала(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ЧР-БЕЛКА ГМР ВИРУСА СУБТИПА ОК(57) Изобретение относится к биотехноло. гии и может быть использовано для получения антигенных детерминант ЧР 1-белка ГМР вируса, Способ получения антигенныхдетерминант вируса предполагает твердофазный синтез пептидов со следующей структурой: (Цис-Цис (200-213)-Про-П ро-Сер (141 - 158- Про-Цис-Гли, или 200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)-Про-Цис-Гли, или Н-Цис (Арг-ТирАсп-Арг-Ал а (141-158)-Л ей-П ро-П ро-Тре Глу-Ал а (20 - 213)-он. синтезатора с использованием полуавтоматического программирования. Все реагенты во всех случаях, за исключением специально оговоренных, являются технически доступными продуктами высшего качества. В качестве дихлорметана применяют продукт (СН 2 С 2) для жидкостной хроматографии с высокой разрешающей способностью. Диизопропилэтиламин (ДИЭА) перед использованием перегоняют из нингидрина, Получают сополимерную смолу (1 о стирола и 1дивинилбензола) в виде шариков с размерами 0,076 - 0,038 мм.Качество защищенных аминокислот оценивают тонкослойной жидкостной хроматографией по углу оптического вращения аминокислотным анализом и масс-спектрографическим анализом.А, Получение аминометиловой смолы. К 100 г тщательно промытой смолы в трехгорлой круглодонной колбе добавляют 16 г (81ммоль) й-(оксиметил)фталимида и 2 л смеси трифторуксусной кислоты с хлористым метиленом в обьемном соотношении 1;1, При интенсивном перемешивании верхнего слоя осторожно добавляют 40 мл (0,44 моль) трифторметансульфокислоты. По истечении б ч реакции при 22 С раствор профильтровывают и подвергают обильной промывке смесью трифторуксусной кислоты с метиленхлоридом в объемном соотношении 1;1, метиленхлоридом, этанолом и наконец вновь метиленхлоридом. Сушат в вакууме, смолу кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч в 2 л этанола, содержавшего 5% гидразина, отфильтровывают в теплом состоянии и промывают 4 порции по 2 л кипящего этанола, 4 порциями по 2 л метанола и 4 порциями по 2 л метиленхлорида, Полученный продукт высушивают в вакууме, Он характеризуется аминовой функциональной активностью 0,836 ммоль/г,В, Получение бок-глицин-(4-(оксиметилфенил)-уксусной кислоты. Проводят синтез бок-глицин-(4-(оксиметилфенил)-уксусной кислоты.С. Присоединение полученного глицина к аминометиловой смоле, 1,4 ммоль бок-гли- (4-(оксиметилфенил)-уксусной кислоты растворяют в 20 мл смеси диметилформамида с хлористым метиленом в объемном соотношении 1,3 при 0 С в присутствии 1,4 ммоль 1-оксибензотризола (ОБТ). Затем добавляют эквивалентное количество (1,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин при О С, после чего дициклогексилмочевину удаляют фильтрованием и верхний слой добавляют. к 4 г аминометиловой смолы, суспендируют в 20 мл метиленхлорида, По истечении 2 ч смолу отфильтровывают, трижды промывают с использованием 40 мл метиленхлорида, а затем суспендируют в 40 мл смеси 0,5 н, уксусного ангидрида с 0,1 М ДИЭА и метиленхлоридом, По истечении еще 2 ч смола становится нингидринотрицательной, Далее смолу трижды промывают 40 мл метиленхлорида, после чего трет-бутилоксикарбонильную защитную группу удаляют в 40 мл смеси трифторуксусной кислоты с метиленхлоридом в обьемном соотношении 1:1.. О. Протокол повторяющегося постадийного синтеза. В каждом случае используют двойное сочетание каждой аминокислоты в трехкратном избытке амина, Хотя Лсп, Гли и Арг подвергнуты двукратному сочетанию в виде их предварительно полученных ОБТ- эфиров, остальные аминокислоты вначале подвергают сочетанию в виде их предварительно полученных ангидридов и повторяютв виде их предварительно полученных ОБТ- эфиров. Нейтрализацию, удаление защитных групп и весь процесс промывки проводят полностью автоматически в соот ветствии с нижеследующим протоколом в15 мл растворителя на 1 г исходной смолы,Смесь 5% ДИЭА(б х 1 мин). В процессе синтеза для получения укороченных иммуногенов удаляют аликвоты30 смолы,Е, Получение 01 К, ЧР (141-158)-ПроЦис-Гли-пептид с 21 остатком.Приблизительно 3 г пептидиловой смолы, содержащей 1,34 г защищенного 01 К,35 ЧР (141-158)-Про-Цис-Гли, обрабатывают30 мл смеси фтористого водорода с и-крезолом в соотношении 9:1 при температуреОСв течение 60 мин, После завершения реакции отщепления смолу выпаривают досуха40 в вакууме при 0 С, после чего промывают 5порциями по 50 мл диэтилового эфира, Освобожденный от защитных групп пептидрастворяют с последовательными обработками уксусной кислотой; 10%-ная уксусная45 кислота (3 порции по 30 мл), 50%-ная уксусная кислота (1 порция 30 мл) и 10%-наяуксусная кислота (3 порции по 30 мл). Пеп, тид сушат вымораживанием с 76-ным выходом, Титрование по Эллману показывает,50 что минимальное содержание свободныхсульфогидрильных групп составляет 70%.Этот пептид чистят с использованием гельпроникающей хромотографии на смоле Сефадекс О - 25 в 10%-ной уксусной кислоте,55 после чего подвергают дитиотреитоловому(ДТТ) восстановлению, получая исключительно гомогенную мономерную фракцию,как это устанавливают жидкостным хроматографическим анализом с высокой разрешающей способностью.Г. Получение ОК, ЧР Лей-Про-Про-Сер (141 - 158)-Про-Цис-Гли пептид с 25 остатками.Приблизительно 1,1 г пептидиловой смолы, которая содержит 0,532 г защищенного ОК, ЧР Лей-Про-Про-Сер (141-158)- Про-Цис-Гли, обрабатывают аналогично вышеизложенному в части Е, в результате чего получают с 84 -ным выходом целевой пептид.6, Получение ОК, ЧР (200 - 213)-ПроПро-Сер (141 - 158) - пептид с 38 остатками.Приблизительно 2,4 г пептидиловой смолы, содержащей 1,29 г защищенного ОК, ЧР (200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)- Про-Цис-Гли, обрабатывают аналогично изложенному в части Е, в результате чего с 97-ным выходом получают целевой пептид,Н. Получение ОК, ЧР Цис-Цис (200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)-Про-Цис-Гли пептид с 40 остатками.Приблизительно 2,5 г пептидиловой . смолы, которая содержит 1,39 г защищенного ОК, ЧР 1 Цис-Цис (200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)-Про-Цис-Гли обрабатывают аналогично изложенному в части Е, в результате чего целевой пептид получают с 97-ным выходом.Получение 01 К, ЧР Н-Цис-Агр-Тир-АспАрг-Асп-Ала (141 - 158)-Лей-Про-Про-Тре Глу-Ала (200 - 213)-он-пептид с 45 остаткаЗащищенную 01 К ЧР Н-Цис -Арг-ТирАсп-Арг-Асп-Ала-(141 - 158)-Лей-Про-Про-Тре Глу-Ала (200 - 213)-пептидиловую смолу обрабатывают аналогично вышеизложенному в части Е, в результате чего получают пептид, указанный в заготовке данной части примера.П р и м е р 2, Химическое присоединение пептидов к К 1 Н через СПДП.Максимально целесообразный уровень нагрузки К Н М-сукцинимидил-(2-пиридитно)-пропинатом (СПДП) определяют в соответствии со степенью осаждения комплекса, которая достигается в течение 60 мин реакции. Устанавливают, что 250-молярный избыток СПДП в соотношении К Н являлся оптимальным, 0,5 г К 1 Н (примерно 1 хммоль) растворяют в 25 мл 0,1 М раствора вторичного фосфата натрия (рН 7,2) при осторожной обработке ультразвуком, Небольшое количество нерастворимого материала удаляют центрифугированием и в верхний слой добавляют 7,81 мг СПДП (2,5 х 10 ммоль) в 625 мкл ДМФ. После прекращения поглощения щелочи образец центрифугируют и обессоливают верхний слой на Сефа 40 45 50 55 5 10 1520 2530 дексе 0-25 в 0,1 М растворе вторичного фосфата натрия при рН 7,2 и скорости 20 см/ч. Устанавливают, что уровень нагрузки, достигнутый в процессе образования производного, составляет приблизительно 40 по ДТТ-восстановлению.К 100 мг функционалиэованного К Н (2 х 10 лиганда) в 25 мл 0,1 М раствора вторичного фосфата натрия (рН 7,2) добавляют десятикратный избыток (44 мг) (141 - 158)- Про-Цис-Гли восстановленного пептида в 600 мкл 0,1 М триметилоламинометила (рН 7,4). За ходом реакции следят по высвобс кдению лиганда, которое практически количественно завершается втечение 60 минпри 22 С, Образец обессоливают на смоле Сефакрил Яв 0,1 М растворе бикарбоната аммония(рН 7,5) и лиофилизируют, Выход пептидов с 21, 25 и 38 остатками в пересчете на лимитированный реагент составляет, соответственно, 84, 85 и 68;.Приготовление композиций на основе пептидов.Все пептиды и продукты сопряжения пептид-К Н растворяют в 10 мкМ триметилоаминометана (рН 8,0) до желаемой концентрации, после чего. разбавляют в соотношении 1:1 комплектной вспомогательной добавкой Фрейнда, Общий объем, а также концентрация антигена, вводимогокаждому животному, описаны для каждогоэксперимента.. Биологический протокол,А. Вакцинация морских свинок. В ходе проведения всех экспериментов используют самок морских свинок весом 450 - 500 г, Каждый вакцинный препарат вводят в организм в указанной дозировке подкожной инъекцией.в объеме по 0,15 мл на каждого члена группы морских свинок из пяти животных. Единственным исключением относительно указанного общего обьема дозы 0,15 мл является доза объемом 0,45 мл, которую используют при антигенном доэировочном титровании для достижения наивысшей установленной концентрации, Контрольную вакцину готовят с использованием штамма О Кал 1 Ьепгеп, являющегося единственным, по которому были опубликованы данные о последовательности. Вакцину готовят с использованием алюминия гидроокисного геля, причем она содержит 1,66 мг сапонина на каждую дозу, Каждой из пяти морских свинок вводят подкожной инъекцией по 1 мл вакцины. В качестве вирусного возбудителя, как указано выше, используют штамм О Кап 1 Ьепгеп, В процессе вирусного титрования проводят разбавление 1/20 с целью получить дозу заражения инфекционных 3000 доз на каждое животное. Всех под1662338 Составитель Т. ЗабойкинаТехред М,Моргентал Корректор О. Кравцова Редактор В, Данко Заказ 2138 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 опытных животных заражают вирусом подкожным введением в подушечку левой задней лапы в объеме 0,02 мл. Каждую зараженную морскую свинку наблюдают в течение последующих 7 дн, следя за развитием вторичных или общих поражений другой задней ноги или передних ног и рта. Критерием защиты служит отсутствие каких-либо вторичных поражений,В. Вакцинация крупного рогатого скота. Для всех.экспериментов используют телок в возрасте от 6 до 8 мес, весивших приблизительно по 150 - 180 кг, смешанного разведения, которые характеризуются восприимчивостью к заболеванию ног и рта, Каждый вакцинный препарат вводят в организм в указанной дозировке путем подкожной иньекции в объеме по 3 мл каждому члену группы иэ трех животных, В каждом эксперименте группу из трех животных не подвергают вакцинации (контрольные животные), Всех животных заражают подкожным введением в язык 10 Ою све 4жетитрованных вирусов О В РЯ в объеме дозы 0,1 мл в десяти точках языка, После заражения животных ежедневно осматриваютдля выявления повышения температуры тела и развития поражения языка и ног, Животные считаются защищенными от заболевания при отсутствии развития каких-либо вторичных поражений по истечении семи дней после их заражения,С. Определение титров нейтрализации сыворотки (ТНС), Для количественной оценки титров нейтрализации сыворотки титры антител ЕЦЯА определяют как направленные против пептида 140 - 160, Во всех вакцинациях с использованием описанных пептидов достигнута крайне тесная взаимосвязь между результатами определений ЕОЯА и титрами нейтрализации сыворотки,11, Биологические результаты. Наиболее убедительным методом определения относительной потенции ряда синтетических пептидных вакцин являетсяметод определения их минимальной за 5 щитной молярной дозировки, Анализ показывает заметное улучшение титровнейтрализации сыворотки и защиты дляпептидов с 38 и 40 остатками в сравнении саналогичными результатами, которые до 10 стигаются при использовании пептида с 21остатком,Пептиды с 38 и 40 остатками являютсяэквивалентными, если о них судить в пределах погрешности эксперимента, вследствие15 чего сводится к минимуму значение аминокислотных концевых цис-цис-остатков в молекулах последних, Оба эти пептидаобеспечивают, по-видимому, полную защиту в дозировке. которая составляет менее20 0,1 - 0,001 дозировки антигенного пептида с21 остатком,При молярной дозировке, сопоставимой с той, которая обеспечивает защиту посредством пептида с 21 остатком в25 комплектной вспомогательной добавкеФрейнда, пептид с 40 остатками обеспечивает полную защиту с комплектной технически доступной добавкой гидрата окисиалюминия. Абсолютный вес антигена, обес 30 печивающего полную защиту морских свинок с использованием этой последнейвспомогательной добавки при однократнойвакцинации, составляет менее 1 мг. 35 Формула изобретенияСпособ получения антигенных детерминант ЧР-белка РМО вируса субтипа ОК, включающий твердофазный синтез пептидов, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что осуществляют синтез 40 пептидов Цис-Цис (200-213)-Про-Про-Сер