Способ определения карфедона в плазме крови

(51)5 6 01 й 33/50 ГОСУДАРСТВЕННЪЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР Е ИЗОБРЕТЕН СА О АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 24цинский стома ,А,СемашкоС.Спектор, А. .В,Крохин ологи.Книжя, т,Х я арма ЕЛЕНИЯ КАРфЕ ОН носится вано д медицине и определения Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения лекарств в биологических жидкостях,Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности способа.Цель достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают хлороформом при соотношении 1;40, хлороформный экстракт упаривают досуха. К сухому остатку добавляют 0,10(,-ный хлороформный раствор внугреннего стандарта 2,4,5,7,8,10 - гексаметил,4,8,10-тетрааза бици кло(4,4,0)декандион,9 (ГТД) и вводят в хроматограф при температуре испарителя 300 С и темпе ратуре колонки 240 С, заполненной фенилметилсиликономфОУна инертоне супер (0,16-0,20 мм).Попытка использовать в качестве экстрагента другие низкокипящие растворители, такие как серный эфир, пентан, гексан, этилацетат, не увенчалась успехом, так как карфедон в них практически нерастворим я способн на коло ахема Бр фаз, такпривод пика ка е трудн Разд ла оптим Сйеп)аро зова ние ЗР, симметри дополни ость системы быке ОУ, фирмы о, так как испольх как Апиезон 1, ло к изменению рфедона, вносило сти с временем ляема альна о.п. Л других ЗЕчности ельны(71) Московский медческий институт им,(54) СПОСОБ ОПРЕДВ ПЛАЗМЕ КРОВИ(57) Изобретение отможет быть использ карфедона в плазме крови. Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности способа, что достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают хлороформом в соотношении 1:40, экстрагируют, упаривают, остаток растворяют в 0,1-ном хлороформном растворе 2, 4, 5, 7, 8, 10-гексаметил,4,8,10-тетраазабицикло (4,4.0) декандиона,9 и хроматографируют на набивной колонке с фазой 5 ф 6 ОУна инертоне супер(0,16 - 0,20 мм) при температуре колонки 240 С, температуре испарителя 300 С и скорости газа носителя 35 мл/мин. 3 табл,Использование в качестве внутреннего стандарта других веществ, таких как пирацетам, который по химической структуре близок к карфедону, было безуспешным;так как в укаэанных условиях на хроматограмме ф пик его накладывается на пики эндогенных ЯЬ веществ. ОЧСнижение температуры колонки и испа- со рителя ниже вышеуказанной резко снижало, Ор чувствительность способа, а увеличение у температуры вышеуказанного интервала приводило к снижению селективности способа, так как пик карфедона накладывалсяна пики эндогенов, удержания, что приводило к снижению чувствительности и селективности способа.Предлагаемый способ позволяет повысить селективность определения карфедона, увеличить чувствительность до МКГколичеств.Способ осуществляют следующим образом,Для нахождения относительных калибровочных коэффициентов карфедона поГТД готовят смеси с точно известным содержанием карфедона и внутреннего стандарта в соотношениях 1:1, 2:1; 3:1; 1:2; 1:3 ихроматографируют в указанных условиях нахроматографе ЛХМв изометрическомрежиме на колонке длиной 1 м, детекторплазменно-ионизационный, скорость лентысамописца 200 мм/ч.Сигнал детектора является линейнымпо отношению к обоим опоеделяемым веществам при данных соотношениях.. В качестве параметра для расчета пиковиспользуют площадь пиков (1 В), которуюрассчитывают как произведение высоты пика на ширину его на половине высоты.Относительный калибровочный коэффициент оказался равным 1,015. Относительная ошибка определения по данныманализа калибровочных смесей составляет,640 (и 7, Р"0,99).П р и м е р 1. Количественное определение карфедона в моче крыс (модельные растворы).Готовят точные растворы карфедона вмоче в концентрациях, указанных в табл.1.1 мл приготовленной искусственнойсмеси помещают в цилиндр, объемом 60 мл,с притертой пробкой, добавляют 40 мл хлороформа и встряхивают на шейкере в тече ние 20 мин, Послеэкстрагирования цилиндрпомещают в морозильную камеру с температурой -150 С,Водныйслой замерзает, а хлороформнцй слой отбирают и помещают в другойцилиндр, после чего экстракт упаривают нароторном испарителе до объема 1 - 2 мл, Остаток количественно переносят в микропробирку с дном, оттянутым в капилляр, иупаривают досуха в токе азота. К сухому остатку добавляют соответствующее количество 0,1 ф-ного раствора ГГД в хлороформе. 1 - 2 мкл полученного раствора вводят микрошприцем в испаритепь хроматографа (температура испарителя 300 С, температура колонки 2400 С), Время удерживания карфедона 8 25, время удержива 3 г яния ГТД 535".Измеряют соотношение площадей пиков карфедона и внутреннего стандарта. Со держание карфедона вычисляют по формуле А= Х К 1/в О,где А - содержание карфедона в микрограммах;Х - отношение площадей пиков карфедона и ГТД; К/з - относительный калибровочный коэффициент;0 - количество добавленного внутреннего стандарта,Результаты определения карфедона в моче (модельные растворы) представлены в табл,1,10 П р и м е р 2. Количественное определение карфедона в плазме крови (модельные растворы). Плазму крыс получают центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Готовят точные растворы карфедо 20 на в плазме крови в концентрациях, указанных в табл.2, 1 мл приготовленного модельного раствора помещают в цилиндр обьемом 60 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл хлороформа и перемешивают на вания поступают аналогично примеру 1.Результаты количественного определения карфедона в плазме крови (модельные растворы) приведены в табл,2. П р и м е р 3, Количественное определение карфедона в плазме крови крыс при внутримышечном введении карфедона в дозе 100 мг/кг, Отбирают кровь крыс-самцов до введения карфедона (контроль) и в течение 8 ч через определенные интервалы времени после внутримцшечного введениякарфедана,Кровь крыс центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, 1 мл полученной плазмы помещают в цилиндр (Ч=60 мл) с притертой пробкой, добавляют 40 мл хлороформа, перемешивают в шейкере в течение 20 мин, далее поступают аналогично примеру 1Результаты определения карфедона в плазме крови крыс при внутримышечном введении приведены в табл.З.Из таблицы видно, что предлагаемый способ, учитывая индивидуальные особенности животных, позволяет надежно и достоверно определять среднее содержание карфедона в плазме крови крыс в различные интервалы времени после его введения,Фо р мул а изобретен и я Способ определения карфедона в плазме крови путем обработки пробы, с последующим измерением, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности способа, пробу об 25 шейкере в течение 20 мин. После перемеши1659854 путем введения полученного раствора в колонку, содержащую в качестве неподвижной фазы 5 ОУна инертоне супер (0,16 - 0,20 мм) при температуре колонки и испарителя 240 и 300 С соответственно и скорости газа носителя азота 35 мл/мин. рабатывают хлороформом в соотношении 1:40, хлороформный экстракт упаривают, растворяют в 0,1-ном хлороформном растворе 2,4,5,7,8,10-гексаметил,4,8,10-тетраазабицикло (4.4.0)декандиона,9. а 5 измерение проводят хроматографически Т абли ца 1 Иетрологические характеристики (при и = 5, Р = 0,95) йдено карфедона,мкг % 92,63 92,63 46,86 . 93,72 100 Ь = 2,72 Ях = 1,25 8 = 2,62 50 10 8,93 89,30 Т а б л и ц а 2 Иетрологические характеристики (при .п =. 5, Р = 0,95) Найдено карфедона кг 0 5,96 85,06 Зз 1 = 1,27 Як = .2,04 8 = 1,67,с = 2,93 с=4,71 42,25 , 84,50 8,19 81,90 5 Е,1.= 3 а б ц а Время с момента введения карфедона, мин держаниеазмн мкг етрояогические харакеристики (при Р 095) енное9 15 14Продолжение табл. 3 50,62 Ях 1,40Е4,45А = 9,038 50,49 43,94 49,24 51,97 53,го 56,20 Х = 51,13 Бх " 2,11 Е=6,71 А = ф"13,13 Х 54, 03 46, 63 45,6356,04 49,28 50,55 56,57 47;10 51,06 50,10 51, 1 3 Х = 5 1, 9 0 Б. = 1,88 Е = 5,98 А +11,52 Х 51,90 Х = 51,73Бх = 0,37Е = 1,8А = +2,298 5169 53,02 51,73 51,97 31,91 Эоз 94 Х = 32,20Бх = 0,797Е = 2,53А = ф 7,74 Х 240 34,90 Э 0,39 Э 2,84 32,20 11,97 Х = 10,65 Бх1,06 Е3,36 А = л 31,55 Х 0,318,138,87 480 10,65 13,97 Составитель А.дгуреевТехред М.Моргентал Корректор И.Муска Редактор А.Долинич Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 Заказ 1839 Тираж 42 О Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открцтиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5