Способ получения аффинного сорбента для фракционирования нуклеиновых кислот

союз советскихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 16555 34 А 12 й 11/10 5 В 0 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ Изобретен для аффинной х спользовано дл РНК. Цель изобр сти сорбтивнотам. Пример 1 ванной целлюлоз стиллированной 40-ного едкого рина. Соотношен люлоза 45; едкии 4,5, Суспензию и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов и Ленинградский технологический институт им. Ленсовета(56) Митрофанов Е.В Зеров Ю.П,Хроматографическое выделение плазмидной ДНК.В кн.: 1 Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. Рига, 1984, с, 156-157.Вйпепапп НМйПег Ю - йисес Асбз Вез. 1978, ч 5, р.1059-1074.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ(57) Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и позволяет повысить селективность разделения нуклеиновых кислот. Микрогранулированную е относится к сорбентам оматографии и может быть я фракционирования ДНК етения - . повышение селек нта к нуклеиновым кисло, 100 см микрогранулиро ы смешивают с 100 см ди з воды, добавляют 10 см з натра и 10 см эпихлоргид ия реагентов, мас.0: цел натр 1,8; эпихлоргидрин еремешивают 2 ч при 40 Сцеллюлозу (100 см . смешивают с 100 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 40-ного едкого натра и эпихлоргидрин в количестве 4,5 - 157 ь от массы реакционной смеси, Суспензию перемешивают 2 ч при 40 С, промывают водой и суспендируют с водным раствором диаминодекана (0,06- 0,357 ь от массы смеси), Перемешивают 20 ч при 35 С и промывают водой и диметилформамидом, добавляют 0,8-1,9 мас, азида й-(2-нитро-окси-хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты в этилацетате с тризтиламином и перемешивают при 4 С 18 ч. Промывают диметилформамидом, метанолом и Я добавляют 7 - 12 мас, дитионита натрия, перемешивают 3 ч при 200 С. Промывают водой, 500 ь-ной СНЗСООН и этиловым спиртом. Добавляют пара-хинон (1,3 - ,3,4 мас.) и гидрохлорид М-(3-диметиламинопропил)- 2-амино-окси-метилбензамид (0,27 - 0,51 мас. ь) в этиловом спирте. Перемешивают 24 ч при 22 С и промывают спиртом и водой. ф Сорбент используют для разделения нукле- ( иновых кислот. 1 табл. (л(Л а затем эпоксицеллюлозу отмывают дистиллированной водой (3000 см ) и суспендируют в водном растворе 150 мг диаминодекана (концентрация диаминодекана 0,06) в течение 20 ч при 35 С,После этого аминодецил-целлюлозу отмывают дистиллированной водой (4000 см )з . и диметилформамидом (500 смз).К 10 см аминодецил-целлюлозы добавзляют 10 см диметилформамида. 0,5 см триз этиламинна и раствор 0,3 г азида М-(2-нитро-окси- хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты в 20 см этилацетата. Содержание й-(2-нитро-окси-хлорбен 1655534зоил)-5-аминокапроновой кислоты в реакционной смеси 0,8 мас,%. Суспензию перемешивают при температуре 4 С в течение 18 ч, а затем промывают диметилформамидом (1000 смз) полученный полупродукт.С целью восстановления нитрогрупп в нем промывают полупродукт метанолом (50 смз), добавляют 100 см 10 -ного водного раствора дитионита Натрия и перемешивают 3 ч при 20 С. Содержание дитионита натрия 7 , Затем сорбент промывают водой (500 смз), 50 -ной уксусной кислотой (200 см ), дистиллированной водой (300 см ,з) этиловым спиртом (200 смз).Формирование иммобилизованных производных актиноцина ведут непосредственно на целлюлозе путем перемешивания суспензии сорбента в 30 см этилового спирта, содержащего 0,1 г гидрохлорида М- (3-диметиламиноп ропил)-2-амино-окси- метилбензамида и 0,5 г парахинона втечение 24 ч при 22 С. Содержание гидрохлорида К- (3-диметиламинопропил)-2-амина-окси- метилбензамида и пара-хинона соответственно равно 0,27 ои 1,3 о .Полученный сорбент отмывают этиловым спиртом 300 сми дистиллированной водой (500 см").В ходе получения сорбента используют азид М-(2-нитро-окси-хлорбензоил)-5- аминокапроновой кислоты, который получают по следующей методике.Синтез азида ч-(2-нитро-окси-хлорбензоил)-5-аминокапроновой кислоты. 0,5 г М-(5-этокосикарбонилпентил)-2-нитро-окси-хлорбензамида растворяют в 15 смз метилового спирта, добавляют 3 см гидраз зин-гидрата, упаривают в два приема и добавляют еще 3 см гидразин-гидрата, Выдерживают 12 ч при 18 - 20 С, защищая от прямого света, и упаривают в вакууме досуха, Остаток от упаривания растворяют в 7 см воды, а затем подкисляют уксуснойзкислотой до рН 6,0 и охлаждают до 5 - 7 С, После выдерживания в течение 10 ч отфильтровывают образовавшийся осадок, промывают его водой и сушат, Выход хроматографически однородного в системах бутанол;3%-ный аммиак(5;2) на пластинках Силуфол ОЧч-(5-гидразокарбонил)-2- нитро-окси-хлорбензамида с т.пл. 180 - 182 С, 0,46 г (77 ), т,пл, 183,5 - 185, 0 С (после кристаллизации из метанола), Найдено, ; М 15,80; 16,17. С 1 ЗН 1 т СМ 405. Вычислено, %: Я 16,25. К раствору 0,69,г (2 ммоль) Щб.гидраеокарбониа-пантин 2-натри;З-о. кси-хлорбензамида в 40 см смеси уксусной и 15(2 соляной кислот при 0-5 С и перемешивании добавляют раствор 0,27 г (4 ммоль) нитрита натрия в 1 см воды. Пере 3 мешивание ведут 15 мин, добавляют 40 смзводы и экстрагируют этилацетатом двумя порциями по 20 смз Экстракт ввиду нестабильности продукта немедленно используютдля дериватизации аминодецил-целлюлозыП р и м е р 2 - 5, Проводили по методикепримера 1. Соотношения использованных реагентов представлены в таблице.П р и м е р 6. Хроматография ДНК, На 10 колонку размером 10 х 30 мм, содержащую4 см аффинного сорбента, полученного в соответствии с примером 1, наносят 0,2 см раствора ДНК из молоки лосося (фирма Яцва, США) в 0,1 М натрий-фосфатном бу фере рН 7,8 (содержание нативной ДНК 7,7О,Е. или 380 мкг ДНК), Несвязавшийся материал смывают тем ке буфером (50 см ).ДНК элюируют буферным раствором, содержащим.0,5 ододецилсульфата натрия, 20 0,5 лаурилсаркозината натрия (150 см ).Собирают фракции объемом по 4 см . Измеряют УФ - поглощение каждой фракции при 260 нм. фракции, содержащее УФ-поглощающий материал, объединяют и осаждают 25 добавлением 2,5 объемом этанола на холоде, Осадок отделяют центрифугированием, растворяют и снимают спектр поглощения в области 220-310 нм.Промывные фракции содержат неболь шое количество УФ-поглощающего материала, осаждаемого этанолом, Спектр поглощения осадка характерен для полисахаридов и представляет собой плавно спадающую от 220 к 310 нм кривую. Элюат 35 содержит чистую ДНК с характерным спектром ( Ямакс = 258 нм, Е 260/;2 зд = 2,5; Еыо/Е 280 = 2,2). Выход ДНК составил 7,5 О.Е, или 98,7 П р и м е р 7. Хроматография ДНК. На 40 колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 смсорбента, полученного в соответствии с примером 2, наносят 7,6 О.Е, нативной ДН К из молоки лосося. Нанесение ДН К, промывку, регистрацию УФ-поглощения, сбор и 45 анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию ДНК выполняют линейным градиентом 0,0 - 0,57 О додецилсульфата натрия в 0,1 М натрийфосфатном буфере рН 7,8. На хроматограмме отчетливо выделяют ся две фракции ДНК. Фракция(элюируетсяот 30 до 40 градиента, содержит 6,2 О,Е.ДНК или 81 онанесенного материала) соответствует основной массе хромосомной ДНК из молоки лосося, Фракция(элюиру ется от 50 одо 70% градиента, содержит 1,3О,Е. ДНК или 17%) соответствует ГЦ-богатой сателлитной ДНК.П р:и м е р 8, Хроматография ДНК. Вусловиях примера 7 проводят разделение5 10 15 20 25 30 35 40 50 препарата ДНК(4,0 О,Е.гбо) измолокилосося, денатурированной нагреванием. Выход ДНК в элюенте (додецилсульфат натрия и саркозилат натрия) составляет 3,8 О.Е, или 95%.П р и м е р 9, Хроматография РНК, На колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см сорбента, полученного в соответствии с примером 5, наносят 2,6 О.Е, раствора дрожжевой РНК (Нала. Швейцария). Нанесение РНК, промывку, регистрацию УФ-поглощения, сбор и анализ фракций выполняю в условиях примера 6. Элюцию РНК выполняютлинейным градиентом 0-1 М перхлората натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8. РНК элюируется в 30 - 40% градиента (0,3 - 0,4 М перхлората натрия), Выход РНК составляет 2,4 О.Е, или 92%П р и м е р 10, Хроматография ДНК. В условиях примера 9 проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О,Е.) из молоки лосося. Ни в одной из фракций элюата не обнаруживается заметных количеств ДНК, В то же время ДНК количественно элюируется (выход 96%) в условиях регенерации колонки; при элюции 0,5% додецилсульфата натрия; 0,5% саркозилата натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8,П р и м е р 11, Хроматография ДНК и РНК, На колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см сорбента, полученного в соответствии с примером 1, наносят искусственную смесь РНК (4,0 О,Е.) и ДН К (7,0 О,Е.), Нанесение пробы, промывку, регистрацию УФ- поглощения, сбор и анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию РНК и ДНК ведут ступенчатым градиентом, На первой ступени - 0,5 М перхлората натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8 - количественно элюируется РГК (выход 95%), на второй ступени - 0,5% додецилсульфата натрия, 0.5% саркозилата натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8 - количественно элюируется ДНК (выход 977)П р и м е р 12. Хроматография ДНК. В условиях примера 6 проводят разделение препарата нативной ДНК(8,0 О.Е,) из молоки лосося на сорбенте, полученном в соответствии с примером 3. Ни в одной из фракций элюата не обнаружено заметных количеств ДНК. Регенерация колонки при элюции 0,5 саркозилатом натрия, 0,5% додецилсульфатом натрия в 0,1 М натрийфосфатном буфере рН 7,8 не позволяет десорбировать связавшуюся ДНК.П р и м е р 13, Хроматография ДНК. В условиях примера 6 проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О,Е.) из молоки лосося на сорбенте, полученном в соответствии с примером 4. ДНК количественно (95%, или 7,6 О,Е,) обнаруживается в проскоке с уравновешивающим буфером, То есть отсутствует связывание с сорбентом.В условиях примеров 6 - 11 проводят 20 циклов фракционирования препаратов нуклеиновых кислот на колонке 10 х 30 мм с сорбентом, полученным по примерам 1,2,5, После каждого цикла колонку регенерируют, промывая последовательно 0,5 додецилсульфатом натрия, 0,5 саркозилатом натрия (20 см, а затем уравновешивали 0,1 М натрий-фосфатным буферным раствором рН 7,8,Сферическая форма микрогранулированной целлюлозы позволяет провести 20 циклов фракционирования без ухудшения гидродинамических свойств. Использованный в качестве лиганда аналог актиноцина позволяет селективно сорбировать нуклеиновые кислоты и отделять ДНК от РНК без уменьшения емкости сорбента, что не достигается на сорбенте, полученном в соответствии с прототипом. Формула изобретения Способ получения аффинного сорбента для фракционирования нуклеиновых кислот, включающий иммобилизацию.комплексона ДН К на поверхности полимерного носителя, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения селективности сорбента к нуклеиновым кислотам, в качестве полимерного носителя используют микрогранулированную целлюлозу, которую последовательно обрабатывают эпихлоргидрином в концентрации 4,5-15% от массы реакционной смеси, диаминодеканом 0,06 - 0,035 мас.%, М-(5-азидокарбонилпентил)-2-н итра-о кси-хлорбе нзам идам 0,8- . 1,9 мас.%, дитионитом натрия 7-12 мас,% и пара-хиноном 1,3 - 3,4 мас,% в присутствии й-(3-диметиламинопропил)-2-амино-окси- метилбензамида гидрохлорида в концентрации 0,27-0,51 % от массы реакционнойсмеси.Тираж 454 Подписное осударственного комитета по иэобретениям и отрытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5