Способ определения активности гормонов тимуса

(5 ОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТНРЫТИЯМ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ нления индукторной б ивгости гормонов тим логической ак а. Цель дости яют ицдуктортимуса, для 3 ается т:.м, что опред ;зо активность гормон его используют клетк государстнеццыи меди утшнико моцослоин епьстн 33/53,свц;ге 01 М) Иэо тцоситс армацев ичсскои прозсобон опре м 1 геди циц ается сской ак шлености и ивцости о ян.яе.ся 1 биоог елью из точност дел они монов. вышени обретеци и сгособ за счет к биоло. ии,втической пр Изобретение едицине, химиос о-фариа це касаетсл способов опактивности ышленности еления биологическои ормон ью иэоб точност яется повыа счет ныяв етения яс пособа гои акти шени сти гормонов пения инд к етодв тим к ку инду иммунсреи рззличА ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) АвторскоеМ 824051, кл,имуса.Цель достигается тем, что опредеяют инлукгорную активность гормонов имуса, для чего используют клетки онослоиной культуры гепатоцитов, реднарительно стимулированные тимиеским гормоном. Стимуляцию проводят ормональным фактором тимуса (в дозе ,1 мг/мл), а индукторную активность 80162282 культуры гепатоцитов, предварительно стимулированные тимическим гормоном, Стимуляцию проводят гормональным фактором тимуса (н дозе 0,1 мг/мг), аи 1 дчктоцую активность определяют как способгость суперцатанта геггатоцитов, стимулированных гормоном, увеличивать кол 1 гстно розеткообраэующих клеток среди г и В лимфоцитон периферической крони челонека по сравнению с коцтро.нем н качестве которого используютуронець 1 зоэеткообраонаигя лимфоцитов н присутстнии супернатанта гепатоцитон, е стимулированных гормоном,С: определяют как способность супернатанта гепатоцитов, стимулированныхгориогом увеличивать количество роэеткообраэующих клеток среди Т и Влимфоцитов периферической крови чело века по сравнению с контролем, в качестве которого используют уровеньрозеткообразования лимфоцитов в присутствии суперцатанта гепатоцитов,не стимулированных гормоном, осцонан на способности гормо са оказывать не только прямо гируищее влияние на дифферен гммунокомпетентных клеток, н циронать продукцию вторичных гуляторных медиаторов клетка ных органов и тканеи.Способ осуществляется следующим образом,Стерильно извлеченную печень животного через нижнюю полую вену перо 5фузируют при 37 С 250 мл 0,02%-ногораствора Версена с содержанием 0,057коллагеназы и 50 ед/мл пенициллина истрептомицина, после чегс осуществляют дополнительную перфузию 80 мл раст вора Хенкса с 0,005 М содержаниемСа и 0,05% содержанием коллагеназы.Далее печень тщательно измельчают,трехкратно отмывают от осяатков крови 30"чО мл 0,02%-ного раствора Версена. Отмытую ткань заливают 200 мпсреды Игла с 0,05% коллагеназы и инокубируют 15 мин при 37 С с постояннымвстряхиванием, После этого клеткитрехкратно отмывают при 0 С 80 мл 20среды Игла от остатков коллагеназы,Полученную суспензию пропускают прио,0 С через стерильную колонку 20 х 2 см,заполненную стекловатой для очисткисуспенэии от клеток макрофагально-моноцитарного ряда, после чего клеткиоставляют оседать, Затем надосадочнуюяядкость отсасывают, клетки помещаютв инкубационную среду: среда Игла ",0 .,эмбриональная телячья сьворотка 20".пенициллин стрептомицин по 10 о мкг/мл,, ФСодержание клеток доводят 3 1 О гепа.тоцитов/мл, Жизнеспособность клетокпроверяют окрашиванием изотоническиь0 6 %-ным раствором трепанового сине О35го. Клеточную суспензию переносят вчашки Петри с находящимися в них предварительно сенсибилизированньми коллагеном предметными стеклами из расчета 4 стекла на чашку. Инкубация всреде 95% Л и 5% СО в течение5-6 ч, За это время клетки адаптируются и образуют монослой на предметныхстеклах, Не прикрепившиеся клетки удаляются вместе с культурально 1 средой.Оцновременно со сменой среды вкаждую культуру добавляется гормональный фактор тимуса в разведении0 1 мг/мл . 11 осле часовой совместной50инкубации оценивается способностьсупернатанта от гепатоцитов, стимулированных гормоном тимуса, влиять наэкспрессию рецепторного аппарата лимфоцитов полученных из периферической955крови человека. Для этого содержаниелимфоцитов, выделенных на градиентеплотности фиколл-уротраст, доводятдо 310 кл в 0,9 мл среды 199 с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки, после чего к 0,9 мпсуспензии лимфоцитов добавляют по0,1 мл супернатанта гепатоцитов, стимулированных гормоном, Каждую пробусупернатанта добавляют в две пробиркис суспензией лимфоцитов: в одну дляопределения влияния на экспрессию рецепторов Т-клеток, в другую - В-клеток, Одновременно с этим в отдельнуюпробирку с 0,9 мл суспензии лимфоцитов для определения прямой биологической активности соединения вносят0,1 мл гормона тимуса в концентрации0.1 мг/мл, Далее лимфоциты инкубируются в течение 1 ч, после чего отмываются, помещаются в 0,2 мл среды 199с 10%-ным содержанием эмбриональнойтелячьей сыворотки В пробирку дляопределения Т-лимфоцитов добавляется0,2 мл отмытых эритроцитов барабана,в пробирку для определения В-лимфоцитов помещается 0,2 кл суспензии зритроцитов барана, сенсибилизированныхгемолитичсской сывороткой и обработанных комплементом мыши, Клетки инкубируются при 37 С в течение 15 мин,после чего в пробирках для определенияна Т-лимфоциты подсчитывается содержание "якявных" розеток. Далее суспензия лимфоцитов помещается на 1 ч в ледяную баню, 11 робы для определениявлияния на В-лимфоциты сразу помещаются на 1 ч в ледяную баню, затем подсчитывается количество общих" розеткообразующих клеток в популяции Т-лимфоцитов и количество розеткообразующих клеток в популяции В-лимфоцитов,За единицу прямой биологической активности гормона принимается способность препарата в разведении 0,1 мг/мп усиливать розеткообразование среди Т-лимфоцитов периферической крови человека на 1%, тогда как единицей инлукторнои активности считается способность гормона в дозе 0,1 мг/мп обеспечивать выброс в супернатант гепатоцитов такой дозы соединений, которая вызьвает стимуляцию розеткообразования в совокупности лимфоцитов периферической крови человека под влиянием супернатанта на 1%, В качестве контроля используются показатели розеткообразователя в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных гормоном тимуса, и в присутствии культуральной среды, 1 б 22820П р и м е р, Стерильно извлеченную крысиную печень перфузируют через нижнюю полую вену при 37 С 250 мл 0,02%-ного раствора Версена с содержанием О, 05% коллагеназы и 50 ед/мл пенициллина и стрептомицина, после чего осуществляют дополнительную перфузию 80 мл раствора Хенкса с 0,05 М содержанием Са и 0,05% содержанием коллагеназы. Далее печень тщательно измельчают, трехкратно отмывают от остатков крови 30-40 мл 0,02%-ного раствора Версена, Отмытую ткань заливают 200 мл среды Игла с 0,05% коллагеназы и инкубируют 15 мин при 37 С при постоянном встряхивании, После этого клетки трехкратцо отмывают при 00 С 80 мл среды Игла от остатков коллагеназы. Полученную суспецзию про пускают при О С через стерильную колонку 20 см х 2 см, заполненную стекловатой для очистки суспензии от клеток макрофагально-моцоцитарного рлда, после чего клетки оставляют оседать, 25 затем надосадочную жидког.ть отсасывают, клетки помещают в инкубационную среду: среда Игла 80%, змбрцоцальцал телячья сыворотка 20., пеццгпилиц, стрептомициц по00 мк и/чл, Сцержа - 30 ние клеток доводят 3 О гепатоцитов/мп, Мизцег.пособность клеток проверяют окрашивацием цзотоническпм О,б%-ным раствором треиацолоо синего, Клеточную суспецзию переносят ц чашки Петри с находящимися в цих предварительно сенсибилизироцаццыми коллагеном предметными стеклами из расче та 4 стекла на чашку, Ицкубацил в среде 95% О и 5% СО в течение 5 - 6 ч, 3 а 40 это время клетки адаптируютг.я и образуют моцослои ца предметцых стеклах, Не прикрепившиеся клетки удаляются вместе с кудьтурадьцой средой, Одновременно со сменои среды в каждую 45 культуру добавляется полипептидцый Фактор тимуса - тималин в разведении 0,1 мг/мл. После часовои совместной инкубации оценивается способцость супернатанта от гепатоцитов, стимули рованных тималином, влиять на зкспрессию рецепторного аппарата лимфоцитов, полученных из периферическои крзви больных с ожоговои травмой 11, 111 степени. Для этого содержание лимфо цитов, выделенных на градиенте плотност фиколл-уротраст, доводят до 3 10 кл в 0,9 мл среды 199 с 10%- ньв содержанием эмбриональной телячьй сыворотки, после чего к 0,9 мл суспензии лимфоцитов добавляют по 0,1 млсупернатанта гепатоцитов, стимулированньс одним из разведений тималина,Каждую пробу супернатанта добавляют в2 пробирки с суспензия лимфоцитов водну для определения влияния на экспрессию рецепторов Т-клеток, в другую - В-клеток. Одновременно с этим вотдельную пробирку, содержащую 0,9 млсуспензии лимфоцитов, вносят 0,1 кптималина в концентрации 0,1 мг/млдля определения прямой биологи ескойактивности соединения, Лимфоциты инкубируются в течение 1 ч, после чего отмываются, помещаются в 0,2 мл среды199 с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. В пробиркудля определения Т-лимфоцитов добавляется 0,2 мл отмытых эритроцитов барана, в пробирку для определения В-лимфоцпов помещается 0,2 мп суспецзиизритроцитов барана, сецсибилизированцыхгмщштической сывороткой ц обработанных комплементом мьпиц, Клеткиоццкубируются при 37 С в течение15 миц, после чего в пробах для определения влияния ца Т-лцмфоццты подсчитываетгя содержание "активных"розеток. Далее суспензия лимфоцитовпомеиигется ца 1 ч п ледяную баню, Пробы дпя определения влцльпл ца В-лимаоциты сразу помещаютгя ц ледяную баню ца 1 ч, затем подсчитывается количество "общих" розеткообразуюцих клеток в популяции Т-лимФоцитов и количество розеткообраэующих клеток в популяции В-пимфоцитов, В качестве контроля используют показатели розеткообразовация в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стиму"ированныхтималицом, и в присутствии культуральнои среды,Предлагаемый способ, в отличие от известного позволяет це только более глубоко анализировать иммунорегулятор,;ую активность тимических гормонов путем одновременной количественной оценки их прямон и индукторной активности, но и дает возможность выявить даже минимальные колебания их уровня среди тималица различных партий. Все это делает предлагаемый способ более качественным и точным, особенно при определении биологической активности тимических гормонов, использующихся в виде лекарственных препаратов,1622820 Формула изобретения Составитель В, Бонарцев Техреа М.Дидык Корректор 0, Кравцова Редактор И, Шмакова Заказ 108 Тирах ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб., л. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 1. Способ определения; активности гормонов тимуса путем оценки их действия на процесс реакции розеткообразования лимфоцитов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повыщения точности способа за счет выявления индукторной активности гормонов тимуса, перед оценкой реакции проводят иикубацию монослойной культурыгепатоцитов в присутствии гормона с 5последующим отделением супернатанта,его очисткой от остаточного количества гормона, внесением в суспензиюлимфоцитов периферической крови, инкубированием, а оценку осуществляютпо возрастанию числа Е-РОК и ЕАС-РОК,