Способ количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах

(51)4 С О 1 Х 33/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье Методы определения азота и сырого протеина, ГОСТ 13496.4-84.Плешков Б.П, Практикум по биохимии растений. М.: Колос, 1976.(57) Изобретение относится к аналитической химии, а более конкретно к способам количественного определения азота (А) и сырого протеина (СП) в биологических материалах, например в кормовых дрожжах. Целью изобретения является экспрессное определение азота и сырого протеина. Способ включает следующие операции: минерализацию образца концентрированной серной кислотой, окисление аммиака до А гипобромитом и фотометрическое опреде" ление концентрации А. Добавление в пробу биологического материала буферного раствора в виде 18-22 см 107-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40-0,48 М растворе едкого натра обеспечивает экспрессное определение А и СП.2 табл.У113253Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах, например в кормовых драж 5 жах.Цель изобретения - экспрессное определение азота и сырого протеина,Способ количественного фотомет 10 рического определения азота и сырого протеина. в биологических материалах осуществляется следующим образом.В колбу Кьельдаля вместимостью 250 см вносят 0,4-0,5 г (точная навеска) измельченного биологического материала с содержанием азота 10- 60 мг, добавляют 8-10 см 30 -ного раствора перекиси водорода, перемешивают, добавляют 13-14 смконцентрированной серной кислоты, содержащей селен, и вйовь хорошо перемешивают. Колбу помещают на электроплитку и проводят озоление до полного обесцвечивания раствора. Время озоления сос тавляет 1,5-2 ч. После осветления раствор охлаждают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см . Раствор доводят до 200 см 1 дистиллированной водой и перемешивают.Для определения азота предлагаемым фотометрическим способом в мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см минерализата с содержанием кон 35 центрированной серной кислоты 0,25- 0,35 см и добавляют 18-22 см 1 О - ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М. растворе едкого натра. Пробы хорошо перемешивают 4зи добавляют 15 см гипобромита, приготовленного при смешивании двух частей 0,07 М раствора гипохлорита и одной части 2%-ного раствора бромистого калия в 10 -ном, растворе двузамещен ного фосфорно-кислого калия, Содержимое колбы вновь хорошо перемешивают и Оставляют стоять 3 мин, затем объем доводят до 100 см дистиллированной водой и вновь перемешивают.Точно так же подготавливают холостую пробу на реактивы, где вместо 5 см 1 минерализата биологического материала вносят 5 см раствора, содержащего, как и в испытуемой пробе, 0,25-0,35 см концентрированной серной кислоты, Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при 330 нм в кюветах с толщиной 62 2слоя 10 мм или на фотоэлектроколори-метре типа КФКпри 365 нм в кюветахс толщиной слоя 30 мм,О содержании азота судят косвеннопо избытку гипобромита, не вступившего в реакцию окисления аммиака доазота. При измерении оптической плотности растворов из-за меньшей окраски, которую имеет испытуемая проба,ее используют в качестве контроля,измеряя относительно нее оптическуюплотность холостой пробы.Содержание азота находят по калибровочной кривой, которую строят в.пределах от 250 до 1500 мкг, используя в качестве стандартного растворааммоний хлористый в концентрации1,91 г/дм.Пересчет на сырой протеин прово-.дят путем умножения количества определенного азота на коэффициет 6,25.С целью уточнения концентрациираствора трехзамещенного фосфорнокислого калия в смеси с едким натром,обеспечивающим рН, оптимальный для .проведения реакции с гипобромитом,проведен ряд экспериментов.В качестве биологического материала используют товарные кормовые дрожжи рода СапйЫа, выпускаемые гидролиэными заводами микробиологическойпромьшшенности, и низший плесневойгриб Раес 1 оаусез сагпепз, выращенный йа гидролизате древесины, Определение сырого протеина проводят фотометрическим и титриметрическим способом. Титриметрический способ взятдля сравнения, как наиболее достоверный и хорошо воспроизводимый.В качестве биологического материала взяты дрожжи, содержащие 50,5%сырого протеина (определяют титриметрическим способом).П р и м е р 1. В мерную колбувместимостью 100 см вносят 5 смкислого минерализата, добавляют избюретки 16 см 1 О/-ного растворатрехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра,перемешивают и добавляют 15 см гипобромита. Пробу вновь хорошо перемешивают и отстаивают 3 мин, затемобъем доводят до 100 см дистиллированной водой, вновь хорошо перемешивают и измеряют оптическую плотностьраствора на. фотоэлектроколориметретипа КФКв кюветах с толщиной слоя30 мм при длине волны 365 нм. ВремяЭ 13253анализа 10 мин, Во всех последующихпримерах время анализа остается практически постоянным. Определено сырогопротеина 48,1%. Результат определе 5ния занижен по сравнению с титриметрическим способом, принятым за эталон,на 4,8 отн,%. Такая точность определения азота неприемлема и полученаиз-за недостаточного количества бу Оферного раствора, взятого меньше минимального количества,П р и м е р 2. Б мерную колбувместимостью 100 см вносят 5 смкислого минерализата, добавляют из 15бюретки при помешивании 18 см 07 ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствореедкого натра и далее по примеру 1.Определено сырого протеина 50,3%, 20Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом составляет 0,47, что являетсявполне приемлемым и соответствует минимальномуиспользованию буферного раствора, 25П р и м е р 3. В мерную колбувместимостью 100 см вносят 5 смкислого минералиэата, добавляют избюретки 20 см 107-ного раствора3трехэамещенного фосфорно-кислого ка- Эцлия в 0,45 М растворе едкого натра идалее по примеру 1Определено сырого протеина 50,7%.Относительное отклонение по срав-Гнению с титриметрическим способом сос 35тавляет 0,47, Данное количество буферного раствора является оптимальным. П р и м е р 4. В мерную колбу" вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют из бюретки 22 см 107-ного раствора трех. замешенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1. 45Определено сырого протеина 51,1%.Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом составляет 1,2%. Точность определения вполне приемлема и соответствует максимальному количеству расходования буферного раствора.П р и м е р 5. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата и добавляют 24 см 10%1ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1.Определено сырого протеина 51,8%. 624Относительное отклонение составляет 2,57. Дальнейшее увеличение количества добавляемого буферного раствора снижает точность измерения и выходит эа рамки выбранного диапазона,П р и м е р 6. Б мерную колбувместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата и добавляют 20 см107-ного раствора трехэамещецногоФосфорно-кислого калия в 0,35 М раст-,воре едкого натра и далее, по примеру 1.Определено сырого протеина 48,97.Относительное отклонение от титриметрйческого способа определения составляет 3,27,. Изменение молярностиза рамки диапазона снижает точностьизмерения,П р и м е р 7, В мерную колбувместимостью 100 см вносят 5 см кис 3лого минерализата и добавляют 20 см10%-ного раствора трехзамещенногоФосфорно-кислого калия в 0,40 М растворе едкого натра и далее по -примеру 1.Определено сырого протеина 50,9%,Относительное отклонение от титриметрического определения составляет0,8%. Точность приемлема и соответствует минимуму необходимой молярности.П р и м е р 8, В мерную колбувместимостью 100 см вносят 5 см минералиэата и добавляют 20 см 107,-но 3го раствора трехзамещенного фосфорнокислого калия в 0,48 М растворе едкого натра и далее по примеру 1.Определено сырого протеина 50,2%.Относительное отклонение от титриметрического определения составляет0,6%. Точность приемлема и соответствует максимуму необходимоймолярности.П р и м е р 9, Б мерную колбу3вместимостью 100 см вносят 5 смминерализата и добавляют 10 см 1079ного раствора трехзамещенного Фосфорно-кислого калия в 0,50 М раствореедкого натра и далее цо примеру 1.Определено сырого протеина 49,9%.Относительное отклонение от титриметрического определения составляет1,2%. Точность определения значительно снижается, так как молярность выше максимума,В табл, 1 представлено определение сырого протеина в кормовых дрожжах рода Сапй 1 йа и в биомассе гриба Раес 1 ошусев сагпецз в зависимости132от количества и концентрации предлагаемого буферного раствора.Из данных табл.следует, что результаты определения азота и сырого протеина, полученные при добавлении 1 ОЕ-ного раствора трехэамещенного Фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра в количестве 18- 22 см , хорошо сопоставимы с титри 5метрическим способом. В этих случаях относительное отклонение от титриметрического способа не превышает 2,5 Е, Оптимальной добавкой является 20 см 103-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра. Добавление такой концентрации при всех определениях имеют. наименьшее относительное отклонение от титриметрического способа, которое не првышает 0,87Добавка свыше 22 см буферного раствора приводит к небольшому, но систематическому завышению результатов определения количества сырого протеина, а при добавлении буферного раствора меньше 18 смз получают данные, отличающиеся от данньгх, полученных титриметрическим способом, ,почти на бй.Добавление к минерализату 20 см 1 ОХ-ного раствора трехзамещенного Фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра обеспечивает достаточно высокую эффективность использования предлагаемого способа, Введение в пробы для анализа 20 см 107,-ного трехзамещенного фосфорно- кислого калия в 0,40 М и 0,48 М растворах едкого натра также дает результаты практически одинаковые с результатами титриметрического анализа. При использовании буферного раствора на 0,50 М едком катре в случае определения сырого, протеина в низшем грибе получен результат выше титриметрического на 4,б отн.Е, что неприемлемо,В табл. 2 приведены сравнительныерезультаты по определению сырого про 53 б 2 6змеина в дрожжах пробы 1, полученныеизвестным и предлагаемым способами.Для анализа один и тот же образецдрожжей подвергают минерализации впяти повторностях. Затем в каждомполученном минерализате проводят трипараллельных определения содержаниясырого протеина различными способами:титриметрическим, фотометрическим О по ГОСТУ, косвенным фотометричеекимпо реакции с гиобромитом после предварительной нейтрализации минерализата 1 М раствором едкого натра и предлагаемым косвенным фотометрическим 5 методом по реакции с гипобромитом после добавления 20 см буферного растзвора 1 ОТ-ного трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствореедкого натра,Проведенная статистическая обработка этих данньгх показывает, что наименьшее отклонение результата прн доверительном уровне 0,95 имеет титриметрический способ определения сырогопротеина. При использовании известного фотометрического способа определения (согласно ГОСТУ) находят сырогопротеина меньше,.в среднем на 1,5 отн.Еи при большем отклонении результата,чем при определении сырого протеинатитриметрическим способом,Формула изобретения35Способ количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах включающий минерализацию образца концентрированнойсерной кислотой, окисление аммиакадо азота гипобромитом и фотометричес-,кое определение азота, о т л и ч а ющ и й с я тем, что с целью экспрессности анализа, после минералиэации в 45 пробу добавляют буферный раствор, состоящий из 18"22 см 10/-ного раствора трехзамещенного ФосФорно-кислогокалия в 0,40-0,48 М растворе едкогонатрия.о В3 ф)1 В 31. 34ц1 Ф 3 ч131 ЦО 1 х оцхоэ оЮ сЧ а в1325362 Т а б л и и а 2 Минералиэат Содержание сырого протеина, 7 полученногометодом фотометрическнм фотометрическим со титриметркческим Предлагаемый с гласноГОСТУ 52,4 52,9 53,2 51,9 53,7 52,7 52,1 49,6 52,8 53,6 52,6 50,0 52,2 52,3 52,9 52,6 52,0 52,6 52,6 52,9 52,3 51,6 50,4 52,0 51,6 50,5 52,0 52,7 52, 1 51 в 2 51,9 53,5 51,4 51,6 52,3 52,3 53,2 50,5 53,2 53,1 52,4 52,7 52,9 52,6 50,7 52,7 61,6 53,2 52,3 53,4 52,7 52,6 53,2 Характеристикакй 8 йои 5241014 51 в 6+О68 52 3+Ою 37 52,6+Оф 52Составитель И.ТарееваТехред В.Кадар Корректор В.Бутяга Редактор А.Козориз Заказ 310/39 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Известныйс нейтрализацией применением буферногораствора