Способ получения ферритинспецифичных антител

,олуч пл дфцого длсорбецт .р 1 тиц селезенки человека иммГ:зуют цд СНВг-сефдроэе 1 В, ицкубцрул СГВг-сефароэу 4 В с Феррити5 цом 3 ч при кс мцатцой температуре и рН 8, 3. Концентрация иммобилизовдццого Ферритицд составляет 7- 10 мг/л уплотцеццого геля.Сыворотку крови кролика, содержапуо антитела к селеэоцочцому Ферритицу человека, получают путем иммуциэации кроликамл раствора, состоящего из смеси 0,5 мл адъювацтд Фрейцдд и 0,5 мл Физиологического раствора, соперждщего 100 мкг Ферритица из селезенки человека. Ицъекции проводят с ицтервалом в одну цеделю3 раза, затем через 3 недели осуществляют четвертую инъекцию и спусти 2010 суток цдчидют отбор крови у жияотцых,Лизиц-сефдроэу получают, ицкубирул ц течение 2 ч при комцатцой температуре 1 мл уплотцеццой дктивцроваццой сефароэы 4 В с 0,2 г Ь-лиэиа,растворенного в 1 мл 0,05 М карбоцатцого буфера с рН 8,9. Суспецэию лидии-сефароэы цецтрифугируют 3 мицпри 1500 я, осадок переводят в 0,1 М 30цатрий-фосфатцый буфер с рН 7,4 иповторно осаждаот. Коццецтрдция иммобилиэокаццого лизина составляет180-200 мг/мл сефароэы.К 0,5 мл Уплотцеццой лиэиц-сефарозы добавляют 3 мл сьворотки кровикролика, содержащей антитела к селеэецочцому ферритицу человека,суспецзию герсмепиваот 20 мцц при комцатцоймпердтуре, Суперцатдцт отделяют путем цетрифугировая суспецзиипри 1500 8 в течение 3 миц, затемсмешивают его с 1 мл уплотненной фер"ритицсефарозы и добавляют 3 мл буфе.ра, сэдерждщего 0,05 М трис-ИС 1 и0,2 М хлористого натрия, рН 8,0. После переменивдция в течецие 1,5 ч прикомцатцой температуре осадок ферри, тин-сефарозы отделяют цецтрифугировацием при 1500 ц в течеце 3 миц ипромывают последовдтельцо 20 объемами каждого иэ следунавх растворов:и) 0,05 М трис-Н;1 рН Я 0 (буфер А), содержащий 0,2 М хлорцстыйнатрий,с 5б) буфер А, сд ржднцй 1 М хлористый цатрцй,.я) буфер А, сол. рждппй 1 М хлористый цд г 1 ц 1 и П, 3/ т-.О,Г) буфр А, се рж О, 2 И хлористый цдтрий.Все рс мывки и последуюпую элюцию проводят в "Гэ "-вдридте (т. е. Иеремешивацием суспецзии сорбецта в объео ме раствора) при температуре 02 С. Ос ажде ци е Фер рити и-с еф ар о эы пр о водят цецтрифугировдцием, как описывалось вьппе. Элоцию циэкоаффиццых антител проводят Й мл 0,05 М глициц-НС 1 буФера, содержащего 0,2 М хлористого натрия, рН 3,0. Высокоаффиццые антитела элоируот я 2 этапа О, 05 М глициц-НС 1 буфером, рН 2,3, содержащим 0,2 М хлористый натрий (по 8 мл). рН полученного раствора доводят до 7,4 путем диалиэа против 0,1 М трис-НС 1 буфера, содержащего 0,2 М хлористый натрий. Затем препарат ано тителлиофилцзуют и хрдцлт при -18 С.Получеццый таким образом препарат при электро 1 орезе в 77-цом полиакриламидцом гел характеризовался одной белковой полосой, соответствующей мол.м. приблиэительцо 160 кДа.При гель-хроматографии ца ТЯК-геле Н 1-60 Г получец один симметричный пик с мол.м. приблиэительцо 160 кЛа. Гель-Фльтрация препарата ца ТБК-геле Н 1-60 Г после его хранения в течение 4 месяцев при -18 С дала один симметричный пик беэ появления видимого ,количества циэкомолекулярных примесей. Получение ферритииспецифичцыхантител по способу-прототипу.При электрофорезе в 77 полиакриламидцом геле препараты содержали однубелковую полосу, соответствующуюмол,м. 160 кДа.При гель-хроматографии ца.ТЯК-геле НЫГ препарата антител цепосредствецно после их выделеция получецодин симметричцый пик с мол.м. приблизительно 160 кЛа,Гель-хроматография препарата цаТИК-геле после его хранения в течецие 4 месяцев показала, что в препарате сохраняется лишь около 207,белка с мол,м. 160 кДа при появлениицизкомолекулярцых примесей, составляющих 807. от исходного количествабелка. Это доказывает цестдбильцостьполученных по способу-прототипу ацтител, что выражается н цакоцлециибольшого количества фрагментов антител при исчезновении цдтивцых иммуцоглобулицов с моц.м, 160 кДд..15 "ис- пр -8 , 1 т,е .л й7 ехЛолатс 1 аВу:т ц 1 ". -г: .ЮГ. 3;Т М ПС 1 уцс.1,1рп К 11 И 1. -ГОЛэут ц еачс.ст трсс ее1 лмуцораднометрц еском 11 ссИ 1 фср 20 Ритц. Лл 1 э 1 г 1 в Г, ИОсят фс рри; 1к:,;1 т;. цг цапробирку, чтс сОО гг тву".т кп цтрс 11 и ф ррт 11; ц . И 1; р;Отв- ре 500 мк /Зае, 1; 1; 10 л25 фракций, пол; 1 ец:ых 1: с. ц,-хрс -м 1 тогафи 1 1.11 аата 1 рр т 1 1: 1пифичСых антител из расе гп0,03 мсЕи 1;1 робирку. Лпль","еОПРЕДЕ 7 е НИ Р ОСЧ - ., Ка К П; . а;30 в примере 2, случецО в О :Опвменте Отношение. свзаццсй с сорбтом рпдиоктвцост к Обл ей р,диоактивцости, вцесенн й 1 пр ру(В/Т) по фрг кям, 1 ок; з 1 Ра с.т Отс ут -35стви с и цти Ге цс вя . ь 1 аюгс 1 .11 Ос.Об ИОсти у коротких пептидц:;.; фрпглстсв.П р и и е р 4. 1 сцсльэс нациепцгибиторов протеина. для стабилизации ПрЕПарата ацТИТЕЛ, ПО".;.НОГпо спссабу-прототипу.АцтигецспецифиИв антитела получают с помощью способа-про.готипа,После довсдепя рН до 7,4 к диализованцому препарату, даелу при гельхроматографии ца ТБК-геле НЫГодин симлетричць 1 пик, добавляют ингибиторы протеиназ; фен 1 лмстисульфоцилфторид в конечной кондецтрации0,5 мМ, Я -аминокапроцовую кислотув конечной концентрации 5 лМ, ЭЛТЛв конечной концентрации 20 мМ.Затемпрепарат хранят при 4 С. Получеццыеданные показывают, что использование таких нцгибиторов протеицаз, 55как фецилметилсульфонилфторид, Е -ами"нокапроновая кислота, ЭЛТЛ, це позволяет достичь цели изобретесяполучить стабилизировацгый препаратантигенспецифичных антител, лцшец 05И Л 1 Е р с, Овр,ЕХ 1 ЕНИ с. Л цт 1 гецсвязывающсй с:пособцост ацтитл1 полученных гредвагаемым и контрол - ным способом.сПолученные способсм с использова - вием объекта изобретения и контрольным способом антитела иодируют по методу, обеспечиваюпему наиболее1 75 мягкие условия реакции. 1-меченые антитела Отделяют от цепререагировавшего Иа12ГРь хромятогра фией на ТЯК-геле Ю 1-60 Г и хранят в лиофилиэоцаццом виде при температуре - 18 С. Непосредственно после гель-хроматографи и после 30 дней25хранения Т-мечене антител используют в цммунорадиометрическом определении ферритина, Лля этого в пробирки вносят ферритиц в количестве от 0,2 до 25 цг ца пробирку,что соответствует концентрации феррцтина в исходном растворе от 5 до 500 мкг/л .Затем добавляот 100 мкл ферритицспедифичцьх антител, меченых изотопом иод(по 0,03-0,08 мкКи ли 5-18 нг антител) и 100 мкл 0,05 М натрий-фосфатцого буфера,соержащего 17. БГ и 0,2% азида цатия. После инкубапи в течение 3 ч ри комнатной температуре в пробирки добавляют 100 мкл 10%-цой (вес/объем) ,:успензии иммуносорбецта, содержащего антитела к селезеночному ферриту, ммобилизованные на микрокристаллиеской целлюлозе, и встряхивают 1 ч ри комнатной температуре. Затем сусецзию центрифугирую г 15 лин при 2000 е, осадки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осамают. В полученных осадках опредеяяют скорость счета радионуклида1, отражающую количество связанньж с иммуносорбентом комплексов ,ерритина со специфическими антите-. лами. Использование предлагаемого способа позволяет получать антитела, антигенсвязывающие свойства которых не изменяются за период хранения 30. суток. В то же время получение антител контрольным спссобом дает антитела,антигенсвязывающие свойства которых за этот же промежуток времени существенно снижаются: уменьшаются значения В /Т. Отношение связанно 1 с сорбентом радиоактивности к общей радиоактивности при концентрации ферритина 500 мкг/л снижается с 63 до 43%, различия величины В/Т в 1 С:ТП 1.11 С .", ВСоставитель Н. КалининТехред М.Дидык Корректор Т. Палий Редактор Л. Павлова Заказ 3723 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауюская наб., д. 4/5 Производственно-нздатсньскнй комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Г 1 гарнна, 10 7 1 ОЗФЙ 6ный протеолитической фрагментации Формула иэобретениМ нативных антител. Короткие пептидные фрагменты антител не обладают Способ получения ферритинспеци- (как было показано в прийере 3) аи- фичных антител путей проведеяня5тигенсвяэывающей активностью и яв- хроматографии иммунной сыворотки на ляются "балластным" материалом. В ферритине,ковалентно свяэайной с то ае время предлагаемый способ 6 сефароэой, о т л и ч а ю щ и й с я сравнении с прототипом позволяет тем, что, с целью ловыюения стабиль" предохранить получаемые ферритииспе" ности целевого продукта, перед хро-. цнфичные антитела от деструкции в матографией иммунную сыворотку обпроцессе хранения. рабатывают лизин-сефароэой.