Способ определения оксидазы бактерий

/С 12 В 1:01) 51) 4 С 12 Б 9/ (С 12 Н 9 ТЕНИЯ ИСАНИ ТВ ЗЫ БАК ится к микроиспользовано обных бактерий. енциации а ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ Й ОТКРЫТИЙф Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(46) 15.05.88. Бюл. В 18 (71) Белорусский государственный институт усовершенствования врачей (72) А. А. Кукулянский и А. Д, Соколовская(56) Кочася Б. 1 йепИИсаИоп оГ Ряе йошопая руосуяиея Ъу 1 Ье охЫаяе геасСхоп. Ба 1 пге Еопйоп, 1956, .:ч. 178, р, 703.Никитин В. М, Справочник методов биохимической экспресс-индикации мик робов. Кишинев, 1986, с. 5-8. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДАТЕРИЙ(57) Изобретение относбиологии и может быть С целью ускорения реакции и повышенияточности оксидазного теста в качествереагента на оксидазу используют 0,51,0 Е-ный водный раствор этилоксиэтилпарафенилендиамина сульфата, которымпропитывают полоски хроматографической бумаги, а исследуемые бактерииобрабатывают суббактериостатическими(ЭДТА-Ба), добавляемой к питательнойсреде, подходящей для роста бактерий.Препарат ЭДТА вводят в состав средыв количестве 0,01-0,047, а штаммывыращивают в течение 24-48 ч до достижения ранней стационарной фазы.Преимущество предложенного способазаключается в ускорении реакции и вы"явлении слабореагирующих штаммов,которые не определялись известнымиоксидазными тестами. 2 табл.1395669 по методу Ковача (известный) 25 (ббштаммов) при использовании реагента (ЭОЭФДсульфата) без предварительной обработки бактерий ЭДТА-Ба 33 (87% штаммов) при использовании того же реагентас предварительной обработкой бактерий ЭДТА-Иа 38 (100% штаммов) Изобретение относится к микробиологии и,может быть использовано для дифференциации аэробных бактерий.Цель изобретения - ускорение ре 5 акции и повышение точности оксидазного теста.В качестве реагента на оксидазу используется этилоксиэтилпарафенилендиамин (ЭОЭФД) сульфат, а исследуемые 10 бактерии предварительно обрабатываются суббактериостатическими дозами натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Ба), добавляемой к среде, на которой выращивают бакте; рии. Препарат ЭДТА-Ба вводят в составпитательной среды на поверхности которой исследуемые штаммы выращивают в в течение 24-48 ч (в зависимости отскорости роста и до достижения ранней стационарной фазы). Концентрацию. ЭДТА-Ба в среде варьируют в диапазоне 0,01-0,04 . При более высоких концентрациях препарата наблюдается бактерностатическое действие. Оптимальная концентрация для большинства иссле дуемых штаммов равна 0,03 . Значение предварительной обработки бактерий ЭДТА".Ба объясняется повышением проницаемости клеточной мембраны и вследствие этого ускорением контакта между Число быстро реагирующих штаммов (15 с) в этих случаях равно соответственно 11 (29 ) штаммов; 15 (39,4%) штаммов; 36 ( 94,7 ) штаммов.П р и м е р 2. Исследуют эффект используемых концентраций ЭОЭФД-сульфата и ЭДТА-Ба на результаты определе. ния оксидазы. С этой целью 38 штаммов 7 видов оксидазопозитивных бактерий (перечисленных в табл. 1) выращивают на питательном агаре с добавлением разных концентраций ЭДТА-Иа (0,005 " 0,06 Х). Полоски хроматографической.бумаги смачивают 0,25; 0,5; 1,0 20 и 4,0 растворами ЭОЭФД-сульфата. Биомассу исследуемых бактерий наносят на увлажненную бумагу платиновой пет" лей. Результаты приведены в табл. 2.,оксидазой и фенилендиаминовым реагентом.П р и м е р 1, Исследуют суточные культуры 7 видов оксидазопозитивных бактерий (38 штаммов) и 5 видов оксидазонегативных бактерий (12 штам" мов) после подращивания на питательном агаре с 0,03 ЭДТА-Ба. Оксидазную активность определяют следующим образом, Полоски хроматографической бумаги (Яс 1 пе 11 ХаиГепс 1) смачивают 0,5%-ным водньм раствором сульфата этилоксиэтилпарафенилендиамина и помещают на дно чашки Петри; микробную массу снимают платиновой петлей с поверхности среды и наносят штрихами на увлажненные полоски бумаги. Быстрая реакция - коричнево-красное окрашивание бумаги в течение 1-15 с. Медленная реакция - такое ке окрашивание бумаги в пределах 16-60 с. Отрицательная реакция - отсутствие какого- либо окрашивания. Окрашивание бумаги за время более 1 мин оценивают как сомнительную реакцию.Результаты сравнительных опытов приведены в табл. 1Как видно из табл, 1, из 38 штаммов оксидазопозитивных бактерий положительную реакцию дали; В табл. 2 приведены результаты определения оптимальных концентрацийЭОЭФД сульфата и ЭДТА-Иа: число штаммов, положительных по оксидазномутесту (число быстро реагирукицих штаимов),Данные табл. 2 свидетельствуют,что оптимум концентрации ЭОЭФЦ-сульфата в растворе находится в пределах0,5-2,0% (в/о), При более низких концентрациях (40,25%) реакция с оксидазопозитивными штаммами выраженаслабо и оценивается как сомнительная,При выходе за верхнюю границу указанного оптимума (М,0%) наблюдают фоновое коричневое окрашивание бумаги,интенсивность которого пропорциональна концентрации реагента, Наличие13956694нилендиамина и тетраметилпарафенилендиамина.Преимущество предложенного способа заключается в ускорении реакции5и выявлении слабореагирующих штаммов,что приводит к повышению скорости иточности оксидазного теста. такого фонового окрашивания затрудняет достоверность учета реакции наоксидазу,Оптимальная концентрация ЭДТА-Бав питательной среде установлена впределах 0,1-0,47 (в/о), причем наибольшее число быстрых реакций наоксидазу получается при обработкештаммов 0,03-0,043 ЭДТА-Ба. Концент О Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я рация 0,043 является пороговой, близкой к бактериостатическим концентрациям. Поэтому в качестве рабочей концентрации предпочтительнее использовать 0,037 ЭДТА-Ба. 15 П р и м е р 3. Штаммы оксидазоположительных и оксидазоотрицательных бактерий засевали на подходящую.для каждого вида питательную среду или 20 не содержащую ЭДТА Бв. Через 18 ч после инкубации при 37 С с помощью секун" домера определяли наличие и скорость оксидазной реакции по предлагаемой методике с использованием ЭОЭФД, а 25 также следующих аналогов: диметилпарафенилендиамина, диметилпарафенилендиамина сЫ -нафтолом, диэтилпарафеЧисло штаммов с быстрой или медленной положительной реакциейВид бактерий" Количествоштаммов Предлагаемый методф Прототи всего без ЭДТА-Ба с ЭДТА-Ба 16 - 60 с до 15 с до 16-60 с до 16-60 с15 с 15 с 10 27 О 2 0 4 0 2 0 О 1 0 0 0 В. ЬгопсМяер 1 са 0 Р. шеппояерИсцш 0 0 011 14 15 8 Всего: 38 36 2 Оксцдаэопоэитивные:Р, аегифпояаР. ша 1 ЬорИХхаР. серасхаР. Г 1 цогеясепяМ. оя 1 оепяя Способ определения оксидазы бактерий,предусматривающий культивирование исследуемой культуры на твердой питательной среде, оценку активности с использованием в качестве реагента парафенилендиаминового соединения, о т л и ч:а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения реакции и повышения точности оксидазного теста, исследуемые культуры выращивают на твердой питательной среде в присутствии натриевой соли этилендиаминуксусной кислоты в количестве от 0,01 до 0,04 мас.Е до достижения стационарной фазы роста, а в качестве реаген,та используют водный раствор этипок-. сиэтилпарафенилендиамин сульфата.Таблица 1 11 11 161 2 О 1 1 О 1 1 1 0 0 0 0 0 01395669 Продолжение табл.1 Вид бактерийф Число штаммов с быстрой или медленной положительной реакциейКоличе.ствоштаммоввсего Прототип Предлагаемый методфф до 15 с 1660 сбез ЭДТА-Юа с ЭДТАа до 16-60 с до 16-60 с15 с 15 с Оксидазонегативные: 0 0 0 А. са 1 соасеЫсия 0 О 0 0 0 . 0 0 0 0 0 О 0 0 О 0 0 0 0 0 0 0 00 Всего: 25 штаммов Р. аегщрпояа, 3 штамма Р. сераса, 5 штаммов Р. щ 3.дагя, 2 штамма К. рпепшоптае и 2 штамма Е. со 1 выделены из клинических материалов, остальные штаммы получены из ГИСКа им. Тарасевича;Концентрации реактивов; ЭДТА.-Ба 0,03%; ЭОЭФД сульфат 1,0%. Т аблица 2 ЭДТА-Иа, %0,01-0,02 ЭОЭФД-сульфат, % 0,03-0,04 0,05"0,06 0-0,005 Положительная реакция проявляется в слабом окрашива.нии бумаги; оценивают как сомнительную 0,25 38(36) 5(2) 33(15) 37(30) 0,5-2,0 Учет реакции затруднен из-за фонового коричневогоокрашивания бумаги под действием ЭОЭФД-сульфата Составитель В, Соина Редактор Т. Лазоренко Техред И,Верес Корректор Л. ПилипенкоЗаказ 2466/26 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Р. чу.дага.яК. рпецшопаеС. ГгецпЖЕ. со 13. 0 О 0 0 0 0