Штамм бактерий bacillus species деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений

(з 1)5 С 02 Р 3 ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР(54) ШТА ЯРЕС 1 ЕЯ - ТОВ И ФЕ ситет НИЙ(57) Испол .Про- ных и фештамм бак ван под но собен ра продукты В морской ьзование:очи нольных зэгря терий Вас 1 ц мером ВКПМ зрушать на и фенолсодер среде. 4 табл стка воды от нефтязнений, Сущность: з зресез депониро- В. Штамм спо-100 нефтежащие соединения К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(56) Авторское свидетельство СССРМ 994567; кл. С 12 К 15/00, 1981.Авторское свидетельство СССРМ 1076446, кл. С 12 К 15/00, 1982. Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки морской и пресной воды,от нефтяных и фенольных загрязнений,Известен штамм 31 гертоп)усез а 1 Ьоах 1 а 1 ез "С", используемый для очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктоц.Штамм способен окислять нефть и вазелиновое масло на высокоминерализованных средах при повышенных температурах культивирования в пределах 60 сут.Наиболее близким кзаявляемому явля- . ется Рзесогпопэз ротса 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм осуществляет деградацию нефти остаточной замэзученности и может быть использован при очистке воды и почвы от загрязнений нефтепродуктами.Недостатком указанного штамма .является невысокая скорость роста Рзевсоп)опаз рииса 36 т.к, максимальная плотность 1,5 х 10 кл/мл штамма РзецбоИ1 попаз росса 36 достигает только на 5-е - 6-е М М БАКТЕРИЙ ВАС 1 05 ДЕСТРУКТОР НЕФТЕПРОДУКНОЛСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕсутки. Повышенная температура культивирования (30 С) усложняют применение штамма Рзедоп)опаз рцОса 36 в полевых и производственных условиях для очистки воды и почвы, Длительность процесса деградации нефти Рзецбоп)опэз росдэ Зб - 30 сут, Количество нефти, утилизированной за это время, достигает 68,4-74,5% - это составляет невысокий уровень утилизации, Неспособность штамма Рзеакоп)опаз рцтЫа 36 расти при 4 С и невозможность его использовать при очистке воды и почвы в холодных районах,Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, обладающего высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводород- и фенолсодержащих соединений в сильно минерализованных средах,Поставленная цель достигается тем, что Вас 0 з зресез 205 - 1/О обладает способностью использовать, в качестве источника питания и энергии, дизельное топливо; гексан, бензол и фенол, окислять углеводородыи фенолы при широком диапазоне их концентрации,Анализ предлагаемого технического решения на критерий "существенное отличие" показал, что штамм ВасИцз зрес 1 ез 205 - 1/О является наиболее активным деструктором нефтепродуктов и фенолсодеркащих соединений и может быть использован в нефтеперерабатывающей промышленности для,очистки сточных вод, содержащих нефтепродукты и фенол. Следовательно, техническое решение соответствует критерию "существенные отличия",Штамм ВасИцз зрес 1 ез 205-1/О выделен из морской воды Южно-Сахалинского побережья научно-исследовательской экспедицией в 1988 году и задепонировэн ВКПМ соответственно под М В,Штамм выявлен экспресс-методом ин 10 15"СИ", позволяющей эффективно выделять штаммы бактерий-деструкторов различных загрязнителей из природной среды(пример 1),Новый штамм ВасИ 1 цз зрес 1 ез 205 - 1/О получен методом накопительной культуры, т,е, многократным пересевом на жидкую минеральную среду МА(предложенную Мойсеевой Л,В и Н,Г.Астротвой) с нефте 25 30 продуктами - дизельное топливо, гексан, бензол и фенол,Выращивание проводили в колбах на качалках (110 об/мин), Обьем среды 200 мл, концентрация нефтепродуктов и фенола 35 Полученный штамм бактерий Васйцз зрес 1 ез 205 - 1/О депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Ви штамм Васйцз зресез ВКПМ Вхарактеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.Культурально-морфологические признаки, Клетки представляют собой гр+, подвикные, перитрихиальное жгутование, спорообрэзующие палочки, размером 1,0 - 1,5 х 0,6 - 0,8 мкм, образует термоустойчи 40 45 вые эндоспоры - размер 0,8 х 0,5 мкм. МПА (28 С, 48 ч) образуют плотные белые колонии, потом становятся бурые, пигмент проникает в субстрат, окрашивает его в соответствующий цвет, Образование пигмента происходит от края к средней части, колонии гладкая. блестящая. МПБ (28 С, 48 ч - образует пленку и муть, Агаризованная среда Кинга - образует пигмент коричнево- бурого цвета. Синтетическая среда нэ мор 50 55 ской воде (28 С, 48 ч) образует мелкие серовато-белые колонии диаметром 1,5 - 2,3 дикации на стандарт-индикаторной среде 20 мм, Колонии на твердых агэризованных средах не ослизняются в течение 30 дней,Физиолого-биохимические признаки,Факультативный анаэроб, Температурныйдиапазон роста в пределах +4 + 43,5 С, оптимум температуры - 27 С, Оптимум рН -7,0-7,2. Рост при 7% КаС 1. Желатину разжижает; крахмал гидролизует; нитраты восстанавливает до нитритов; индол,сероводород, аммиак не образует. Каталазоположительные. Липолитическая активность - отрицательная, Лецитиназная -вариабильна. Реакция Фогес-Проскауэра -положительная. Отношение к источникамуглерода. Хорошо усваивает и растет с образованием кислоты на глюкозе, арабинозе,манните, ксилозе.Штамм хранится на агаризованной среде МАследующего состава (г/л):Вода водопроводная 1 лМПА 30 гККОз 1 гйаНРО 4 1 гМэС 1 1,5 гО,1, а /-аланин 1 у/млДестибиотин 1 у/млрН 7,0-7,2В качестве источника углерода вносится1% нефтепродуктов или фенола. Хра 1 чят подслоем стерильного вазелинового масла, пересев 2 раза в 4 года.В табл,1 представлены данные по влиянию различных антибиотиков на штаммВасИ 1 цз зресез ВКПМ В.Штамм Вас 1 Ицз зрес 1 ез ВКПМ В идентифицирован по определителю Верги(1974) какк разновидность группы Вас 1 Ицз.П р и м е р 1. Экспресс-метод индикациибактерий-деструкторов углеводород" ифенолсодержащих соединений.Приготовление стандартно-индикаторной среды осуществляют путем смешиванияагар-эгара с синтетической средой (МА) идобавлением дибромтимосульфофталеином+ продукт метаболизма тест-культурыаВас 1 Ицз зрес 1 ез 13, Тест-культура полученана жидкой синтетической среде МАна 16сутки культивирования при температуре 2527 С. Подвержена тепловой обработке методом 3-х разовой пастеризации споследующей фильтрацией. Добавляется раланин, необходимый для роста в среде бактерий-деструкторов нефти, нефтепродуктови фенола,Состав индикаторной среды (г/л);Водопроводная вода 1 лАгар-агар 20 гИнди като р 1 млПродукты метаболизма 15 млКЙОз 1 ГМа 2 Н Р 04 1 гР-Аланин 1 у/млрН 7,0-7,2Стерильную индикаторную среду разливают в пластмассовые бакпечатки в количестве 10 мл. На остывшую поверхностьсреды накладывают бумажные диски, пропитанные нефтью, нефтепродуктами иливысокотоксичными соединениями типа фенола. Среда может храниться в течение 3месяцев при температуре+3+15 С, На подготовленную т.о, поверхность наносят пробы морской или пресной воды в количестве0,1 мл, оставляют при температуре 18-25 Св течение 12-24 ч. По изменению цвета среды первоначального желто-соломенногоцвета в интенсивный темно-зеленый - судято наличии бактерий-деструкторов, способных расти в присутствии углеродсодержащих и фенольных соединений,Полученные штаммы бактерий-деструкторов очищают путем многократных пересевов на твердой синтетической среде МА,Штамм проверятся на деструктивнуюактивность и способность разлагать дизельное топливо, гексан, бутанол, фенол.П р и м е р 2. Микробная деструкциядизельного топлива осуществляется штаммом Вас 1 Ицз зрес 1 еэ ВКПМ Вна морской среде следующего состава:Морская соль 2%ИН 4 С (аммонийхлористый) 1 г/лКалий фосфорнокислыйдвузамещенный К 2 НР 04или Иа 2 НР 04 1 г/лДестибиотин 0,001% илиДрожжевой экстракт 1 мл/лВода водопроводная 1 лрн 7,2-7,5В качестве субстрата для деструкциивводили; дизельное топливо в количестве500 мг/л, 250 мг/л, 150 мг/л, 100 мг/л, 50мг/л, 1050 мг/л,рН среды регулировали 10 О/ раствором КаОН, Деструкцию проводили штаммом ВасШцэ зрес 1 ез ВКПМ Вна,носителе перлит фильтровальный (ТУ-3144-82) в количестве 10 г/л,В колбы обьемом 1 л вводили морскуюсреду - 500 мл, бактерии носитель вводилиодновременно. Колбы помещали в первые 6часов на качалки 100-120 об/мин.5 Последующее культивирование осуществляли в стационарных условиях при 18"С.Результаты деструкции учитывались через24, 48, 72 и 120 ч, методом количественногоопределения. Результаты представлены в10 табл,2,Таким образом. скорость микробной де.- струкции дизельного топлива штаммомВас 111 цэ эрес 1 еэ 50 мг в сутки. Результатымикробного разложения бензола приведе 15 ны в примере 3,П р и м е р 3. При микробной деструкциибензола готовили раствор морской воды вышеприведенного состава (пример 2).Бензол в качестве субстрата вводили в20 количестве 500 мг, 250 мг, 150 мг, 100 мг, 50мг и 1050 мг/л, Результаты деструкции учитывали через 24, 48, 72 и 120 ч. Результатыпредставлены. в табл.3.. Таким образом, скорость микробной де 25 струкции бензола составляла 100 мг в сутки,П р и м е р 4, Микробную деструкцию вкомплексе гексан + фенол осуществлялиспособом, описанным в примере 1, Гексан+фенол в качестве субстрата для деструкции,30 вводили в соотношении 1:1 в количестве 250мг/л, 150 мг/л 50 мг/л и 25 мг/л.Результаты деструкции учитывали через 3, 5, 8, 10 и 16 суток. методом количественного определения субстрата. Резуль 35 таты представлены в табл,4,Таим образом, скорость микробной деструкции гексана + фенола составляла 100мг за 8 сут.Сопоставив приведенные примеры40 можно сделать вывод, что использованиепредлагаемого штамма Вас 11 цэ эрес 1 еэВКПМ Впозволяет осуществлять деструкцию дизельного топлива со скоростью50 мг в сутки, бензола - 100 мг в сутки,45 гексан + фенол - 100 мг за 8 сут на 98-1.00 фв морской воде.Применение предлагаемого штаммаВас 111 цэ эрес 1 еэ ВКПМ Вувеличит эффективность очистки от нефтепродуктов и50 фенола в условиях реального производства.Формула изобретенияШтамм бактерии Вас 1 Пцэ эрес 1 еэ ВКПМВ- деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений.1784592Таблица 1Таблиц Микробная деструкция штаммом Васйцз зресез ВКПМ Вдизельного топлива в морской воде /периодических условиях/Таблица 3 Микробная деструкция бензола в морской вод штаммом Вас 1 Пцз зрес 1 ез ВКПМ В/перидическое культивирование/убстра ветру Бенз Бенз Бенз Бенз Бенз Бензлица Микробная деструкция гексанэ и фенола штаммо ВасПцз зрес 1 ез ВКПМ Вв морской воде /при периодическом культивировании/Составитель Н,Асторовактор Т.Горячева Техред М.Моргентал Корректор Е,Папп аказ 4346 Тираж . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 1