Способ получения глутаматдегидрогеназы

.Дильбарканов ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ К АВТОРСКОМУ СВИ(71) Институт молекулярной биологии и биохимии АН КазССР(56) Авторское свидетельство СССР У 958502, кл. С 12 Я 9/06, 1981.Гильманов М.К. и др. Методы очист"ки и изучения ферментов растений. Алма-Ата: Наука, 1981.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ(57) Изобретение относится к областибиотехнологии, в частности к технологии получения ферментных препаратов. Цель изобретения - упрощение и уско-рение процесса получения глутаматде гидрогеназы, а также более полное использование сырья. Способ заключается в гомогенизации исходного растительного сырья, в качестве которогопредлагается использовать отруби пшеницы, получении бесклеточного экстракта и выделении из него мембранносвязанной глутаматдегидрогеназы гельхроматографией на сефарозе 2 В. Полученный препарат глутаматдегидрогеназы может быть использован в связанном с мембранами состоянии или подвергнут последующему отделению с "мембраны обработкой фосфолипазой вколичестве 0,5-1 мкг на 1 мл ферментного препарата с получением свободного фермента. Применение способа позволяет значительно упростить и ускорить процесс выделения двух типов препарата глутаматдегидрогеназы. 1 з.п,ф-лы, 395 б 70И зобретение относится к биотехнологии, а конкретно к технологии получения Ферментных препаратов,Цель изобретения - упрощение иускорение процесса получения глутаматдегидрогенаэы, а также более полного использования сырья.Способ заключается в том, что в,качестве исходного растительного 10сырья используются отруби пшеницы,из бесклеточного экстракта которыхс помощью гель-хроматографии на сефарозе 2 В вьделяют связанную с мембранами глутаматдегидрогеназу. Глутаматдегидрогеназа может быть использована в связанном с мембранами состоянии или подвергнута обработке фос-,фолипазой С для получения гомогенного и свободного от фосфолипидов препарата фермента. Получение гомогенного по белку препарата глутаматдегидрогеназы эа одну стадию хромато графической очистки приводит к упрощению и ускорению процесса, а вьделение из одной порции исходного сырьясвободной и связанной с мембранами, глутаматдегидрогеназы позволяет комплексно использовать это сырье.Способ иллюстрируется следующими 30примерами.П р и м е р 1. 100 г отрубей пшеницы тщательно гомогенизируют в фар форовой ступке в 0,05 М трис-НС 1 бу"фере рН 7,4, в соотношении навескиотрубей к объему буфера 1:5, послечего гомогенат центрифугируют при10000 х В в течение 10 мин. Надосадочную жидкость подвергают гель-хроматографии на колонке с сефараэой 2 В. 40Бесклеточный экстракт разделяетсяна два пика. Высокомолекулярный пиксодержит только мембранно-связаннуюглутаматдегидрогеназу в виде округлых субклеточных структур размероМ 45около 1 мкм. Взвешивание упаренногои освобожденного от буферных солейпрепарата показывает, что из 100 готрубей получается 47 мг мембранносвязанной глутаматдегидрогеназы в50расчете на белок), а общая массамембрано-связанного фермента равна980 мг,Эффективным спосЬбом освобожденияглутаматдегидрогенаэы от мембран является обработка фосфолипазой С вконцентрации не меньшей чем на 1 млраствора мембранно-связанной глутаматдегидрогеназы. Освобожденная отмембран гомогенная глутаматдегидрогеназа является термостабильным фермент ом (температура инактивации 80 С), что делает ее перспективной биотехнологии, Молекулярная масса глутаматдегидрогеназы, определенная при электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия - 55 кЛа.П р и м е р 2, Способ осуществляют по примеру 1, но используют 0,5 мкм Форсфолипазы С на 1 мл мембрано-связанной фракции, Получают препарат глутаматдегидрогеназы, свободной от фосфолипидов.П р и м е р 3. Вьделение проводят по примеру 1, но используют фосфолипаэы Д или А. В обоих случаях не происходит отделения глутаматдегидрогеназы от фосфолипидов.П р и м е р 4. Вьделение проводят по примеру 1, но используют сефадекс- Г. Мембранно-связанная глутаматдегидрогенаэа загрязняется другими высокомолекулярными продуктами.Таким образом, использование предложенного способа позволяет значительно упростить и ускорить процесс вьделения за счет исключения многостадийной хроматографической очистки препарата, а кроме того, комплексно использовать исходное сырье для вьделения как свободной, так и связанной с мембранами глутаматдегидрогеназы.формула изобретения 1. Способ получения глутаматдегидрогеназы, включающий гомогениза" цию растительного сырья в буферном растворе, отделение бесклеточного экстракта и вьделение из экстракта целевого продукта хроматографическими методами, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, в качестве растительного сырья используют отруби пшеницы, а вьделение глутаматдегидрогенаэы из экстракта проводят гель- хроматографией на сефарозе 2 В.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью более полного использования сырья, проводят обработку полученной после гель- хроматографии связанной с мембранами глутаматдегидрогеназы фосфолипазой С в количестве 0,5-1 мкг на 1 мл препарата с последующим получением свободной глутаматдегидрогеназы,