Штамм бактерий рsеudомоnаs sp. 4а-деструктор углеводородов и ксенобиотиков

(19) 0 12 И 1/20, С С 12 Б 1./20,Р 3/3412 Н 1;38 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ Т СССРОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЛЬСТВ Ви АВТОРС верань идетельство СССР12 Б 1/20, 1984 ся к микро- ости и касаетий, который для очисткизагрязнений. получени адающего активно сам угле сильно(71) Одесский государственный уситет им. И. И. Мечникова(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РБЕ 1 Л)ОМОБАЯДЕСТРУКТОР УГЛЕВОДОРОДОВ И КСЕНТИКОВ(57) Изобретение относитбиологической промышленнся нового штамма бактерможет быть использованморской воды от нефтяныхЦелью изобретения являетсянового штамма бактерий, облболее высокой деструктивнойстью по отношению к комплекводородов и ксенобиотиков в минерализованньк срезах. Штамм Рзецйошопаз зр.ВКПМ В(4 а) выделен из морской воды Берингова моря и обладает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть и нефтепродукты, в которых главный компонент --алканы с высокой (С19 С 1 и средней молекулярной массой (Сь-С ), окислять углеводороды и азокрасители в широком диапазоне концентраций, Максимальная скорость деградации углеводородов составляет; нефти 0,4 г/л, вазелинового.масла 0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти + + с-ксилола 33,3 мг/л, дизельного с топлива + о-ксилола 20 мг/л в 1, сут. ЭФфект деструкции азокрасителей составляет: красителя красного 2 мг/л, оранжевого 1,04 мг/л, желтого 3,12 мг/л в 1 ч. Новый штамм способен расти в средах с содержанием ЯаС 1 3-123 и вышее, устойчив к солям тяже лых металлов. 12 табл.18 1395667 Таблица 10 Субстрат для деструкци 96 200 Краситель - красный 84 150 100 100 125 60 100 1 ОО 36 100 24 50 100 25 12 100 432 ч=18 сут 100 900 мг/л Таблица 11 Субстрат для деструкции Количество угле Время, ч Эффектводорода, кон- деструкцентрация, мг/л ции, 7. 200 Краситель - оранжевый 192 98 175 168 99 150 144 100 125 120 100 100 100 100 100 48 25 900 мг/л Количество углеводорода, концентрация, мг/л Время, ч Эффект деструкции, % 24 100864 ч=37 сут 10020 19 1395667 Табли ца 12 Время,: ч Субстрат для деструкции 64 Краситель - желтый 200 100 56 150 100 48 100 40 125 100 32 100 100 24 75 100 16 ф 100 25 352 ч=15 сут 100 900 мг/л Составитель 3, ФалунинаРедактор Я, Недолуженко Техред И,Верес Корректор Г. Решетник Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 Количество углеводорода, концентрация, мг/л Заказ 2466/26 Тираж 520 ПодписноеВШ 1 ИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Эффектдеструкции, ХИзобретение относится к микробиологической промышленности и касаетсянового штамма бактерий, который можетбыть использован для очистки морскойводы от нефтяных загрязнений.Цель изобретения - получение нового штамма бактерий; обладающегоболее высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам угле Оводородов и ксенобиотиков в сильноминерализованных средах.Штамм бактерий Ряеийошопая яр.ВКПМ В(4-а) выделен из морскойводы Берингова моря в 1981 г. и обладает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть инефтепродукты, в которых главный компонент - н -алканы с высокой (С, -Сзб)и средней молекулярной массой (от С 6 2 Одо С ), окислять углеводороды пришироком диапазоне их концентрации,Полное разрушение углеводородов иксенобиотиков происходит в морскойсреде при использовании дополнительных биогенных субстратов, например,дестибиотина, дрожжевого экстракта,Штамм Ряеийошопая яресея 4-а об,ладает следующими признаками.Морфолого-культуральные признаки.Прямые палочки, размеры 1-2 х 0,5-0,6 мкм, подвижные, грамотрицательные, неспорообразующие,На рыбо-пептонном агаре.колониибесцветные с гладкими краями, круглые, блестящие, выпуклые, консистенция однородная, диаметр колоний 34 мм,На рыбо-пептонном бульоне рост ввиде равномерного помутнения, 4 ОРастет на средах с морской водойи на обычных лабораторных субстратах.Колонии вначале прозрачные, потомстановятся слегка кремовыми. НеспороОбразующие. 45 На среде Кинг: дополнительных пигментов не образует,На среде с Твин, Твин; образует фермент липазу. 50На синтетической среде (морскаясоль 1,8 , аммоний хлористый 1,0 г/л,калий фосФорно-кислый двузамещенный1,0 г/л, дестибиотин (0,001%-ного растВора) или дрожжевой экстракт 1 мл/л 55вода водопроводная 1000 мл, рН среды7,2-7,5) с добавкой нефти и нефтепродуктов: дисперсный рост с помутнением среды.Отношение к углеводородам, Растет на средах, содержащих нефть, парафин, О-ксилол, дизельное топливо, вазелиновое масло, смазочное масло, Разлагает ксенобиотики, относящиеся к диа-. зосоединениям. Отношение к антибиотикам: не чувствителен к метициллину, оксациллину, линкомицину, новобиоцину, ристомицину, слабо чувствителен к стрептомицину, мономицину, ЧуВствителен к канамицину, карбенициллину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, левомицину, олеандомицину, полимиксину. Отношение к источникам азота; бактерии штамма Ряеийошопая яресея 4-а-гетеротрофы и могут использовать следующие амминные соединения:.Фор мамидАцет амидПропионамидФлюороацетамидГлюколамидАкриламидЛактамид НСОЯН,СНСОИНСН СН СОИНСН РСОБНСН ОНСОИН.,СН, =СНСОНН,СН,СНОНСО 1 Н,В качестве факторов роста могут использовать:-алании, метионин, 1-лизин, пролин, 1,-аргинин, Ь-гистидин, аспарагин, изолейцин, лейцин и валин.Устойчивость к солям тяжелых металлов проиллюстрирована в табл, 1,Состав среды для получения биомассы бактерий штамма Ряепйошопая яресея 4-а: рыбо-пептонный агар ЗФизиолого-биохимические признаки.Факультативный аэроб, Способен расти при температуре от -10 до 42,5 С.Оптимум роста 20-27 С. Рост на средес ЛаС 1 5, 7, 10%-ной и выше,Отношение к рН; оптимум роста в области рН 6,5-8,0, с максимумом прирН 7,5. Выше рН 8,0 и ниже рН 6,5рост удовлетворительный.Оксидазы и каталазы образует, лецитиназы не образует, молоко пептонизирует, желатин разжижает. Рост на средеИаС 1 0,5, 3, 5, 7 и 1 О .-ной и вьппе.Оптимум роста при 3-5%-ной ИаС 1. Индол сероводород и аммиак не образует.Реакция Фогэс-Проскауэра - отрицательнаяОбразует кислоту на среде с глюкозой без наличия газа, Хорошо растут на среде с лактозой и маннитомбез образования кислоты и газа, 1395667(0,0017.-ный раствор) или дрожжевойэкстракт 1 мп/л, рН среды 7,0-7,2.Условия хранения: на скошенном агаре рыбо-пептонном под.стерильным медицинским вазелиновым маслом илн глицерином при 4 С или в лиофилизированномсостоянии.ОШтамм Рвецс 1 ошопая вресхея 4-а был.получен путем испытания на чувствительность морских микроорганизмов кразличным источникам углерода,Для получения использовалась следу.5ющая среда, г/л:-агар-агар 14,5 г,пептон рыбный 14,5 г, морская соль.18 г, дестибиотин (17. в .Иый раствор)0,1 мл. Водопроводную. воду добавлялидо 1 л рН среды 7,0-7,2.20Расплавленную среду разливали по15-20 мл в стерильные чашки Петри.Поверхность застывшей среды засевали чистой культурой бактерий Ряецйошопая зресея 4-а в количестве, 250,1 мл/500 млн. взвеси (устанавливаютпо бактериальному стандарту). Материал наносят с помощью стеклянногошпателя или бактериологической петлие 30Бактериальную взвесь равномернораспределяли, чашки подсушивали, после чего на поверхность засеянной среды накладывали диски, пропитанныеразличными источниками углеводорода,напрймер нефть, нефтепродукты, ксенобиотики. Чашки культивировали при25-27 С в течение 12-24 ч и по отсутствию зон вблизи углеводородсодержащих источников или наличию их Опре 40деляли способность штамма Рзецйошопазвресхев 4-а расти в присутствии различных химических субстратовСопоставительный .анализ до деструкции углеводородов и -ксенобиотиковразличными штаммами бактерий пред-.ставлены в табл. 2.Из табл. 2 видно, что штамм бактерий Рвеийошопаз яр. 4-а способен разлагать любой из класса углеводородсодержащих.субстратов. А из классаазокрасителей он расщепляет все ксенобиотики.Кроме того, скорость разложенияштаммов Рвецйошопаз зр. 4-а - тетраазокрасителя в 2 раза вьппе. Такаявысокая активность штамма обуславливает значительный экологический эффект. Деструктивная активность штамма, Ряецйошопая яр. 4-а в минерализованной среде (морской воде) представлена в табл, 3,Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, Штамм Ряецйошопазяресея 4-а выращивали .на морскойсреде следующего состава; морскаясоль 1,87., аммоний хлористый 1,0 г/л,калий фосфорнокислый двузамещенный1,0 г/л, дестибиотин 0,0017. раствораили дрожжевой экстракт 1 мл, вода:водопроводная 1000 мл, рН среды 7,2 -7,5.Нефть в качестве субстрата длядеструкции вводили. н количестве мг/л:450, 400, 350, 300, 250, 200, 150,100, 50.и 2250. рН среды регулировали107.-ным раствором БаОН.Деструкцию проводили штаммом Рвеийошопая зресея 4-а, предварительнокультивированньи на рыбо-пептонномагаре,(РПА) в течение 24-36 ч при22 С и дважды отмытым минеральнойсредой указанного состава (без углеводородов) посредством центрифугирования нри 4 тыс.об/мин в, течение10 мин.С целью создания оптимальных условий для деструкции углеводородовклетками бактерий штамм в первые 2 чпомещали на качалку. Последующеекультивирование Осуществляли в стационарных условиях при 22 С.Результаты деструкции учитывалипо исчезновению нефтяной пленки через 27,ч, 24 ч, 21 ч, 18 ч, 15 ч,12 ч, 9 ч, 6 ч, 3 ч и 6 сут.Результаты представлены в табл. 4.лСкорость микробной деструкцииштаммом Рзецйошоиая яр. 4-а нефтипри этом достигает 16,6 мг/л в 1 ч.Деструкцию вазелинового масла осуществляли в морской воде, следующейконцентрации, мг/л: 500, 450, 400,350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 и2750,Результаты деструкции штаммомРяецйошопая яресея 4-а регистрировали через 60 ч, 54 ч, 48 ч, 42 ч,36 ч, 30 ч, 24 ч, 18 ч, 12 ч, 6 ч и14 сут по исчезновению вазелиновогомасла в среде.Результаты микробного разложениявазелинового масла представлены втабл, 5.Скорость микробной деструкции ваэелинового масла 8,3 мг/л в 1 ч.П р и и е р 2, При микробнойдеструкции смазочного масла готовилиискусственный раствор морской воды,приведенный в примере 1. Смазочноемасло в качестве субстрата вносилив следующем количестве, мг/л: 450,400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 1050, 25 и 2275,Результаты деструкции учитывалипо исчезновению в среде пленки через,30 сут, 24 сут, 18 сут, 12 сут, 156 сут, 3 сут и 9 мес,Результаты деструкции смазочногомасла приведены в табл, 6.Скорость микробной деструкции 208,2 мг/л в 1 сут,Микробное разложение дизельноготоплива осуществляли в морской воде,;13 сут, 10 сут, 7,5 сут, 5 сут,2,5 сут, 1,3 сут и 3,5 мес. 30Результаты биодеградации дизельного топлива штаммом Рэеийошопаз зр,;4-а представлены в табл. 7.Скорость микробной деструкции дизельного топлива 19,5 мг/л в сутки,П р и м е р 3, Микробную деструкцию комплексов углеводородов: нефтьи о -ксилол и дизельное топливо о -ксилол осуществляли приведенным способом 40Количество нефти о -ксилола, а также дизельного топлива о -ксилола вносили в морскую воду для биодеградациив следующем количестве, мг/л: 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700,Результаты деструкции нефти ио-ксилола учитывали через 1,5 сут,3 сут, 6 сут, 9 сут, 12 сут,15 сут,18 сут и 21 сут по исчезновению в среде нефти и О -ксилола,Данные микробного разложения нефти и о -ксилола представлены в табл, 8. Скорость микробной деструкции нефти и о-ксилола 33,3 мг/г в сутки.Результаты разложения дизельного топлива и о -ксилола под воздействием бактерий регистрировали через 2,5 сут 5 сут, 10 сут, 15 сут, 20 сут, 25 сут,30 сут, 35 сут, по исчезновению в морской воде дизельного топлива и о-ксилола (табл. 9),Скорость микробной деструкции дизельного топлива и о -ксилола 20 мг/лв 1 сут,П р и м е р 4. Микробную деструкцию штаммов Рзецйошопаз зресез4-а осуществляли в морской средеукаэанного состава в примере 1.Ксенобиотики: краситель оранжевый(огап 1 е СВ), красный (ген С-бс.с),желтый (уе 11 о-Г), вносили в следующем количестве, мг/л: 200, 1/5, 150,125, 00, 75, 50, 25 и 900.Результаты биодеструкции азокрасителя - красный учитывали через 96 ч,84 ч, 72 ч, 60 ч, 48 ч, 36 ч, 24 ч,12 ч по исчезновению оранжевой окраски в среде ( табл. 10).Скорость микробной деструкции азокрасителя-красный 2,0 мг /л в 1 ч.Результаты микробного разложения азокрасителя-оранжевый учитывали через 192 ч, 168 ч, 144 ч, 120 ч, 96 ч, 72 ч, 48 ч, 24 ч по исчезновению оранжевой окрас.ки в среде (табл, 11).Скорость микробной деструкции азокрасителя-оранжевый - 1,04 мг/л в1 ч.Данные биодеградации азокрасителяжелтый учитывали через 64 ч, 56 ч,48 ч, 40 ч, 32 ч, 24 ч, 16 ч, 8 ч поисчезновению желтой окраски в среде(табл, 12),Скорость микробной деструкции азокрасителя-желтый - 3,12 мг/л в час,Таким образом, штамм Рзепйошопаз зресез 4-а способен расти при низких(-10 С) и высоких температурах (42,5 С); максимальная скорость деградации углеводородов составляет: нефти 0,4 г/л, вазелинового масла 0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л, дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти и о -кснлола 3,3 мг/л, дизельного топлива и о -ксилола 20 мг/л в сутки, а максимальная скорость деградации ксенобиотиков, входящих в группу азокрасителей соответственно составляет: красителя красного 2,0 мг/л, оранжевого 1,04 мг/л желтого3,12 мг/л, в 1 ч, эффект деструкцииуглеводородов и ксенобиотнков при1395667 Формула и з обретен и я этом составляет 98-1007., устойчив ксолям тяжелых металлов от 25/мл до1000/мл, способен расти в средахс содержанием ИаС 1 (3-127 и выше) свысокой степенью .деградации.,Штамм бактерий Ряепбпшопая яр.ВКПМ Вдеструктор углеводородови ксенобиотиков. Таблица 1 Концентрация, 11/мл 100 500 750 50 75 Соли тяжелых металлов Са Н 8 Сг Таблица 2 Количество штамма и скорость деструкции Птаммы бактерий М 1 сгососсия яр,1 МРя. яресеяВРя. яресея 4-а 16,6 мг/л в. ч .33,3 мг/л в сут0,2 г/л в сут8,2 мг/л в сут НефтьНефть + о -ксилол Ваэелиновое масло Смазочное масло 19,5 мг/л в сут Дизельное топливо Дизельное топливо ++ краситель (гес 1.Сс.с) 100 мг/лч Субстрат для деструкции 0-ксилол + краситель10 1395667 Продолжение табл.2 Субстрат для деструкции Количество штамма и скорость дест-.укции Штаммы бактерий гососсцв вр исаев 4-а Рв. вресьееВтрукция ксекобиотиков Азокрасителей 2,0 мг/л в час 00 мг/л12 мг/л в 00 мг/лсут 1,04 мг л в абли страт для деструкции Кол-во сре 2, 5-3 2 мазочное масл,5 2,510 3,0 5-3 6 2, 5-3 аблица Субстрат для деструк В струкции, % о еф 450 7 0 моноазокраситель:кислотный красный(ген Сс,с) иазокраситель:пряой/субстантивный/желтый - Яцпс 1 допш етраазокрасительрямой яркоранжевый - Огапд углеводорода, мг/100 Содержа ние БаС в среде2 1395667 Продолжение табл,4 21 8 30 0 0 О 100 9 250 мг 34 ч=6 су бли Колич В Эфф о ч е о 6 8 0 4 8 48 4 350 9 36 0 3 0 0 2 24 150 2 100 5 100 750 мг 007 и 1Субстрат д деструкции зелиновое масло орода,ентрацг(л 40 ч=14 с оо 00 деструкции, Ж300 250 100 100 13 200 10 100 150 7,5 100 5 1002,5 1001,3 100 1 ОО 50 25 ю 2275 мг/л 115,3 сут = 100- 3,5 мес Субстрат для деструкцииСмазочное масло Количество углеводорода,концентрация,мг/л 432 ч = 18 сут 288 ч = 12 сут 144 ч = 06 сут 72 ч = 3 сут 273 сут = 9 мес Таблица 7 Эффект деструкции, Е15 1395667 Таблица 8 Эффект деструкции, % Количество углево- Время,дорода, концент- сутрация, мг/л Субстрат для дест- рукции 2 350 + 350 = 700 300 + 300 = 600 250 + 250 = 500 200 + 200 = 400 150 + 150 = 300 100 + 100 = 200 50 + 50 = 100 25 + 25 = 50 Нефть +ксилол 98 18 99 12 100 100 100 100 100 1,5 Таблица 9 Субстрат для деструкции Количество углево- Время, Эффект дедорода, концентра- сут струкции,ции, мг/л Х Дизельное топливоб-ксилол 350 + 350 = 700 97 300 + 300 = 600 250 + 250 = 500 200 + 200 = 400 150 + 150 = 300 100 + 100 = 200 50 + 50 = 100 25 + 25 = 50 30 25 99 20 100 100 10 100 100 100