Способ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК и 4 С 01 И 33/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИС АНИЕ ИЗОБР ЕНИ ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 4076897/28-1410.06.8615,04.88. Бюл. У 14Научно-исследовательский инстиедиатрии АМН СССР и Московскийтут тонкой химической технологии(72) Т. М. и И.В (53) (56) ей В3,паса 815,(54) СПОСО МАЛОНОВОГО (57) Изобре медицине, п мембранных гических со задержкой в организм шение инфо этого 1,1, 5 мкмолей)2-3 мин пр водят в трис-НС 1 буфере, рН 7,4 до конц. 10-15 ммолей в 20 мкл. В пробе периферической крови (0,5 мл) трижды отмывают эритроциты физраствором, готовят 5%-ную взвесь эритроцитов и по 400 мкл вносят в параллельные пробы, добавляя по 450 мкл трис-НС 1 буфера.В контроль (без эритроцитов) вносят 850 мкл буфера. В 1-ю пробу и в контроль вносят по 10 мкл свежеприготовленного МДА, во 2-ю пробу - 10 мкл буфера. Все три пробы инкубируют 1 мин при 37 С, добавляют по 500 мкл 30%-ной трихлоруксусной кислоты, 150 мкл 5 М НС 1, 600 мкл О, 67%-ной тиобар" В ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТАБОЛИЗМА битуровой кислоты. Пробы ставят в баню ДИАЛЬДЕГИДА В ЭРИТРОНКТАХ при 100 С на 40-60 мин, затем в протение относится к биохимии и зрачком центрифугате определяют опредназначено длядиагностики тическую плотность и кол-во МДА во нарушений у детей при патоло- всех 3 - х пробах на Сфпри Я -532 нм.стояниях, сопровождающихся Степень деградации К 1 А определяют помалонового диальдегида (ИЩА) сле вычитания кол-ва МДА во 2-й прое. Цель изобретения - новы- . бе из 1-й пробы и выражают в % от рмативности способа. Для , контрольной пробы. % деградации бо,3-тетраметоксипропан (1- " лее точен, чем нм, т.к. не меняется гидролизуют О, 1 И НС 1 при добавлении в пробы эритроцитов и 40 С, нейтрализуют и раэ- ЩА в количестве 5-20 нм. 2 табл.Изобретение относится к биохимии:и медицине и может быть использованов диагностике мембра.нных нарушенийу детей при различных патологическихсостояниях, сопровождающихся задержкой малонового диальдегида (1 ЯА) ворганизме,Цель изобретения - повышение информативности способа за счет дополнительного определения степени деградации МДА,Способ осуществляется следующим: 2-3 мин при 40 С с последующей нейтрализацией и разводят в трис-НС 1 буфере,рН 7,4 до концентрации 10 - 15 нмолей 20в 20 мкл. Берут периферическую кровь(0,5 мл), трижды отмывают эритроцитыфизраствором, приготавливают 5%-ювзвесь эритроцитов и по 400 мкл вносят в параллельные пробы, в которыедобавляют по 450 мкл трис-НС 1 буфера.В контрольную пробу (без эритроцитов)вносят 850 мкл буфера. В 1-ю пробуэритроцитов и в контрольную пробувносят точно по 10 мкл свежеприготовленного МДА, а во 2-ю пробу - 10 мклбуфера, Все три пробы инкубируют неменее 1 мин при 37 С, после чего добавляют по 500 мкл 30 -ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), Добавляют150 мкл 5 М НС 1 и 600 мкл 0,67 -нойтиобарбитуровой кислоты (ТБК), Пробыставят в баню при 100 С и после 4060 мин в прозрачном центрифугате определяют оптическую плотность, а затем количество МДА во всех трех пробах на СФпри длине волны 532 нм.Степень деградации МДА определяют после вычитания количества МДА во второй пробе из первой пробы и выражают 45в % от контрольной пробы. При этомответ вдеградации: более точен, чемв нМ, поскольку возможны некоторыенеточности в приготовлении новыхдоз МДА. Процент деградации МДА неменяется при добавлении в пробы эритроцитов МДА в количестве 5-20 нМ.П р и м е р . Берут 3 капли периферической крови, эритроциты трижды отмывают физраствором, готовят 5 -ювзвесь эритроцитов в трис-НС 1 буферес добавлением КС 1 (50 мкл взвеси эритроцитов 950 мкл буфера), готовят две пробы эритроцитов: 400 мкл 5 -й взвеси эритроцитоэ +450 мкл трис-НС 1 буфера и во вторую пробу добавляют 10 мкл экзогенного МДА (10 нМ), который приготовлен путем гидролиза 1, 1,3,3-тетраметоксипропана О, 1 н, НС 1 3 мин при 40 С с последующей нейтрализацией О, 1 н. ИаОН. Такую же дозу МДА Добавляют в третью пробу, содержащую 850 мкл трис-.НС 1 буфера. Все три пробы инкубируют 3 мин при 37 С, затем добавляют 500 мкл 30 ТХУ, 150 мкл 5 н. НС 1 и 600 мкл 0,67 -й ТБК, ставят в баню при 98 С на 20 мин, центрифугируют при 3000 об./мин 15 мин и надосадочную жидкость спектрофотометрируют (в микроватах) при двух длинах волн: 532 и 600 на отечественном спектрофотометре СФ. Степень деградации МДА определяют путем вычитания экстинции второй пробы из первой и деления на экстинцию третьей пробы, умножая на 100 для получения ответа в процентах.В табл. 1 представлены конкретные примеры определения степени деградации ЩА эритроцитамиВ табл. 2 представлены данные о степени деградации МДА в эритроцитах у здоровых детей разного возраста, взрослых и при некоторых патологичес - ких состояниях у детей.Формула изобретенияСпособ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах путем исследования опытной пробы, содержащей эритроциты, и контрольной, не содержащей эритроцитов пробы, добавления в пробы трихлоруксусной кислоты, соляной кислоты и тиобарбитуровой кислоты с последующим нагреванием проб, охлаждением и спектрофотомегрированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения информативности способа за счет дополнительного определения степени деградации малонового диальдегида, готовят две пробы, содержащие эритроциты, в одну из них и в пробу, не содержащую эритроцитов, добавляют малоновый диальдегид, инкубируют пробы не менее 1 мин, а степень деградации малонового диальдегида определяют как раз1388805 ность оптических плотностей в пробахс эритроцитами, содержащей и не содержащей добавленный малоновый диальдегнд, деленную на оптическую плотность пробы, не содержащей эритроцитов. Таблица 1 Проба 2 Проба 3 Проба 1 3 деградации; нМ/пробе Е. нМ/пробе Е нМ/пробе МДА 41,1 3,103 29,3 3,74 22,8 4,12 34,9 3,52 21,2 4,33 17,2 4,55 18,1 14,3 4,80 8,3 5,14 23,4 5,43 40,5 4,84 15,9 12 Проба 1 - проба эритроцитов с экзогенным и эндогеннымФ 1МДА,Проба 2 - проба эритроцитов с эндогенным МДА.Проба 3 - проба без эритроцитов (Трис-НС 1 буфер) с экзогенным МДА.П р и м е ч а н и е: С 1 по 6 - пробы эритроцитов недоношенных детей равнойстепени тяжести; с 7 по 10 - пробы эритроцитов роженицво время родов; с 11 по 12 - эритроциты после предварительной инкубации с экзогенным МДА (15 мин 37 (".)и последующего 2-3-кратного промывания их физраствором,Таблица 2 ные дети 3-5 дней жизни Ново 16,35 + 1,7 2,27 + ети 6 лет 46,5 + 3,83 27,6 + .1,65 Дети 14-16 лет, и = 6Взрослые люди 35-65 лп = 6 0,365 0,440 0,485 0,415 0,510 0,535 0,538 0,565 0,605 0,510 0,570 0,650 0,005 0,010 0,014 О, 017 О, 026 0,027 О, 040 О, 043 О, 046 О, 050 0,2480,195 0,05 0,610 5, 18 0,08 0,610 5,18 О, Г 20 0,610 5,18 0,15 0,610 5,18 0,21 0) 615 523 0,22 0,615 5,23 0,33 0)610 5, 18 0 36 О 610 5 18 0,39 О) 610 5, 18 0,42 0,610 5,18 2,11 0,540 4,59 1,66 0,540 4,591388805 Продолжение табл.2 Новорожденные с нарушением мозгового кровообращения, и = 8Дети 5-6 лет с церебральныи параличом, п = 10 9,65 + 0,67 26,3 + 1,32 Составитель Н. ГуляеваТехред А. Кравчук Корректор Л, Пилипенко Редактор Т. Парфенова Тираж 847ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 1576/47 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4