Способ определения количества жизнеспособных клеток в сушеных дрожжах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 4615 9) (1 1/06,(5 Ц 4 С 12 Я 1/ОЬ//(С С 12 К 1:865) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСКОМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВАЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК В СУШЕНЫХДРОЖЖАХ(57) Изобретение относится к микро"биологии и аналитической биохимии,в частности к способам определенияколичества жизнеспособных клеток всушеных дрожжах. Целью изобретенияявляется ускорение процесса определения. Способ заключается в том, чтосушеные дрожжи суспендируют в дистиллированной воде, затем центрифугируют в пробирке, на дне которой находятся параллельные к стенкам электроды, при 1800-4000 об/мин в течение2-7 мин, после чего измеряют электропроводность уплотненных междуэлектродами дрожжевых клеток и покалибровочной кривой определяют количество жизнеспособных клеток. 1 нл.1 табл.615 1 1384Изобретение относится к аналитической биохимии и микробиологии, в частности к способам определения количества живых клеток сушеных дро" жей.Цель изобретения - ускорение процесса определения.Способ заключается в том, что степень электропроводности уплотненных до постоянной величины электропровод- ности регидратированных дрожжевых клеток зависит от количества живых клеток, При более высоком количестве неживых клеток наблюдается большая электропроводность уплотненной дрожжевой суспензии, так как пространство между суспендированными дрожжевыми клетками увеличивается и оно содержит больше электролитов. Межклеточное пространство увеличивается, если оболочка клетки не способна деформироваться, что свидетельствует о повреждении клетки. При одинаковом межклеточном пространстве электропровод- ность повышается, если из клетки диффундирует больше электролитов, что свидетельствует о том, что мембраны клетки повреждены в процессе высушивания дрожжей.Таким .образом, электропроводность уплотненной суспензии сушеных дрожжей свидетельствует о количестве живых клеток.Сушеные дрожжи суспендируют в дистиллированной воде, перемешивают до получения однородной суспензии, затем центрифугируют в пробирке, на дне которой находятся параллельные к стенкам электроды. Центрифугирование проводят при оборотах центрифуги 1800- 4000 об/мин, диаметр ротора ЗО см, внутренний диаметр центрифужной пробирки 20 мм, расстояние между элект" родами 1,5 мм. Затем измеряют электропроводность уплотненных между электродами дрожжевых клеток при 5 кГц, используя мост для измерения. полной проводимости, и по калибровочной кривой определяют количество живых клеток.Проводя измерения при 5 кГц, ка-. либровочный график строят, откладывая на оси абсцисс активную электропроводность уплотненной водяной суспензии сушеных дрожжей, измереннойОпри 18-20 С, а на оси ординат - количество живых клеток в процентах от общего числа дрожжевых клеток, которое определяется методом витальногоокрашивания. Для статической достоверности результат анализа каждогообразца получен путем подсчета неменее 1000 дрожжевых клеток,В случае измерения электропроводности при 500 кГц калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисссоотношение реактивной и активнойэлектропроводностей, измеренных при500 кГц и 18-20 С, а на оси ординат - количество живых клеток в процентах от общего числа дрожжевых15 клеток.Центрифугирование проводят приоборотах центрифуги 1800-4000 об/мин.При оборотах ниже 1800 об/минклетки между электродами недостаточ 2 О но уплотняются, в результате чего,между клетками остается пространство,участвующее в электропроводимостибез участия клеток, что не позволяетдостигнуть постоянную электропровод 25 ность и дает искаженные результаты,При оборотах центрифуги выше4000 об/мин клетки могут дополнительно повреждаться, в результате чегомежду электродами может оставатьсяЗО только мембранный материал без электролитов; что также вызывает, неточныерезультаты;Время центрифугирования должнобыть 2-7 мин, При меньшем временицентрифугирования не достигаетсяуплотненность клеток, при которойэлектропроводность становится постоянной.При центрифугировании выше 7 мин40 может изменяться электропроводностьуплотненной суспензии, так как в результате жизнедеятельности из клетки в анаэробных условиях могут выделяться органические кислоты, увели 45 чивающие электропроводность, что приводит к неточным результатам.Способ поясняется конкретнымипримерами.П р и м е р 1. 40 мг сушеных дрожВо жей суспендируют в 1 мл дистиллироованной воды при 18-20 С, перемешивают в течение 2 мин и центрифугируютв течение 5 мин. Затем определяютактивную электропроводностьуплотненной при 5 кГц между электродами водяной суспензии сушеных дрожжей, которая равна 0,3 10 /Ом см. По калибровочному графику определяют количество живых клеток, которое равно 807.1384615 П р и м е р 2, 60 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1,5 мл дистиллированной воды при 18-20 С и проводят определение как в примере 1. Электропроводность равна 1,0 10 /Ом см-з 5 и количество живых клеток соответственно 20%.П р и м е р 3. 80 мг сушеных дрожжей суспендируют в 2 мл дистиллированной воды и проводят определение аналогично как в примере 1. Электропроводность равна 0,610 /Ом см и количество живых клеток соответственно 433. 15П р и м е р 4. 40 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1 мл дистиллироованной воды при 18-20 С, перемешивают в течение 2 мин и центрифугируют в течение 7 мин. Затем определяют соотношение реактивной и активной электропроводностей уплотненной между электродами водяной суспензии сушеных дрожжей при 500 кГц, которое равно 0,35. По калибровочному графику (см. чертеж) определяют количество живых клеток, которое равно 577. П р и м е р 5. 60 мг сушеных дрожжей суспендируют в 1,5 мл дистиллированной воды и проводят определение аналогично как в примере 4. СоотношеПримечания Электропровод- Количестность, 1/Ом см во живыхклеток,7 Опыт 0,4 10 2000 0,30 10 0,31 1 О 0,30 1 О 0,31 10 0,29 10 80 2000 2000 2000 80 2000 79 81 2000 0,32 10 2000 Время цент- Скорость центрифугиро- рифугирования, вания, мин об/мин ние реактивной и активной электропроводностей равно 0,50 и количество живых клеток соответственно 80%.В таблице представлены данные определения содержания количества живых клеток в сушеных дрожжах в зависимости от времени и скорости центрифугирования. Определение проводилось как в примере 1.Таким образом, использование предлагаемого способа сокращает процесс определения содержания живых клеток в сушеных дрожжах до 15 мин,Формула изобретения Способ определения количества жизнеспособных клеток в сушеных дрожжах, предусматривающий приготовление водной суспензии дрожжей и расчет количества жизнеспособных клеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения процесса определения, суспензию дрожжей центрифугируют в течение 2-7 мин при 1800- 4000 об/мин, измеряют электропровод- ность уплотненных дрожжевых клеток и по ее величине рассчитывают коли-. чество жизнеспособных клеток с учетом предварительно построенного калибровочного графика. 64 Электропроводность меняется, результаты искаженыПодписноемитета СССРткрытийкая наб., д,Увеличивается электКлетки недостаточноуплотнены, результаты неточные Клетки в процессе центрифугирования повреждены; результаты неточные - по