Способ разделения смеси фитогормонов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИН 4 С 01 И ННЫЙ КОМИТЕТ ССС ЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ ГОСУДАРС ПО ДЕЛА ЕНИ 3 088. 8),В, ТруденетикеВавилова, Л., 1134-139.идетельство СССС 01 И 33/48, 1ДЕЛЕНИЯ СМЕСИ Ф л ы по пр и селек ии.78,83.ТОГОР ится к областк выделениюЦелью изобреие точности ич ентеи способа.том, что лиофический материал щ спиртом,РастПИСАНИЕ ИЗОБРЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(57) Изобретение отнбиологии, в частнострастительных гормонотения является повышрасширение возможносСпособ заключается влизированный биологиэкстрагируют метилов,ЯО .изи 79 воритель отгоняют, Водный раствор центрифугируют, очищают толуолом и доводят рН раствора до 9-10 добавлением раствора щелочи, Из раствора сначала удаляют жирные кислоты,аминокислоты, пигменты, катионы и др, соединения на колонке окиси алюминия, затем осаждают белковые вещества концентрированным раствором уксусно- кислого свинца, центрифугируют, добав. ляют к центрифугату 107.-ный сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют, Центрифугат подкисляют 5 н.НС 1 до рН 2- 2,5 и фитогормоны извлекают 2-3 раза равными объемами (1:1) очищенного% серного эфира. Затем проводят хромато графию на адсорбенте. Фитогормоны проявляют путем опрыскивания раствором флуоресцеина с последующим воз- С действием парами брома и освещением ультрафиолетовым светом. 1 табл.45 Изобретение относится к биологии, в частности к выделению растительных гормонов (гибберелловой, индолилук. сусной кислот, цитокининов) и являетР 5 ся усовершенствованием способа по авт.св. 9 1164598.Цель изобретения - пов 1 шение точности и расширение возможности способа. 10Ранее не были известны способы извлечения фитогормонов из материалов животных организмов.Способ осуществляют следующим образом. 15Лиофилизированный биологический материап экстрагируют охлажденным доо-5-7 С подкисленным 807-ным метиловым спиртом (0,5 мл 0,1 н, НС 1 на 100 мл спирта) при -5-7 С в течение 62-63 ч. 20 Спиртовой экстракт взбалтывают на качалке в течение 3 ч при комнатной температуре, после чего продолжают экстракцию при охлаждении еще 18 ч.о Центрифугируют экстракт при 0 С (при 25 5000 об,/мин в течение 5-10 мин с последующим повторным центрифугированием со свежей порцией растворителя. Растворитель отгоняют под струей воздуха от вентиляторов30Водный раствор центрифугируют при комнатной температуре при 5000 об/мин в течение 15-20 мин, очищают толуолом и доводят рН раствора до 9-10 добавлением раствора щелочи (20 Е-ной ИаОН). Из раствора сначала удаляют жирные кислоты, аминокислоты, Пигменты, катионы и другие соединения на колонке с окисью алюминия, затем осаждают белковые вещества концентрированным 4 О раствором уксусно-кислого свинца, центрифугируют 10 мин при 5000 об,/мин добавляют к центрифугату 107-ный сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют,Центрифугат подкисляют 5 н. НС 1 до рН 2-2,5 и фитогормоны извлекают 2-3 раза равными объемами (1:1) очищенного серного эфира. Объединенные зытяжки серного эфира упаривяют В токе воздуха досуха, остаток растворяют в 2 мл этилового спирта и хроматографируют в тонком слое адсорбента воответствии с основным способом.1 р и м е р 1. 5 г лиофилизированкого луба виноградной лозы экстрагируют подкисленным 807-ным метиловым пиртом (0,3 л, 62 ч) при температуре -7 С (в холодильнике), Спиртовой экстракт взбалтывают на механической качалке при комнатной температуре в течение 3 ч и снова выдерживают 18 чопри -7 С, После центрифугирования прио=0 С (5000 об/мин в течение 40 мин) спиртовой экстракт отделяют, а осадок размешивают в 40 мл растворителя и центрифугируют 10 мин при тех же условиях, Объединенные экстракты отгоняют под струей воздуха от вентиляторов. Водный раствор ( =80 мл) центрифугируют при комнатной температуре (5000 об./мин в течение 20 мин), К центрифугату добавляют равный объем толуола, встряхивают, декантируют и удаляют верхний слой, Эту операцию повторяют дважды.Реакцию раствора,цо рН 9 доводят 202-нойл МаОН, наносят ка колонку с окисью алюминия, элюируют водой, Из 100 мл элюата белки осаждают концентрированным раствором уксусно-кислого свинца, центрифугируют (10 мин при 5000 об,/мин), к цецтрифугату добавляют 10 Е-пый сульфат натрия до полного удаления катионов свища и снова центрифугируют. Водный остаток подкисляют до рН 2 с помощью 5 н. НС 1 трижды фракционируют с равными объемами (1:1) очищенным серным эфиром. Эфирные фракции кислых соединении упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл 962-ного эти,пового спирта и хроматографируют фитогормоны в соответствии с основным способом.В качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса С, силикагеля с люминесцентным индикатором УФи крахмала при массовом соотношении 63:15:14:8. Сефадекс, силикагель, крахмал и целлюлозу последовательно в отдельности суспендируют в деглонизированной воде (на 15 г смеси 60 .мл воды), После суспендирования каждого компонента смеси суспензию размешивают 1 мин. Указанное количество адсорбента достаточно для приготовления десяти пластинок. Для приготовления пластинок со слоем комбинированного адсорбента используют стекляные, тщательно обезжиренные фотопластины (23,7 х 8,7 см),Полученную сорбционную массу наливают на пластинки и сушат в строго горизонтальном положении на воздухе не менее 3 ч, что обеспечивает получение слоя 100 мкм, Пластинки активиоруют при 90 С в течение 15 ч. Хрома 1335879тографию фитогормонов проводят прио20 С. Растворы наносят микрошприцем, Для хроматографирования фитогормонов используют подкисленный 80 Е-ный водный этанольный раствор (из расчета 0,5 мл НС 1 на 10 мл спирта). На пластинку наносят пробы различных количеств смеси по 1-3 мкл раствора, содержащего 17-64,5 мкг фитогормонов, После нанесения растворов стартовую линию подсушивают феном в течение 2-3 мин.Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером 150 х 150 х 200 мм, Расход растворителя составляет 80 мл, Для разделения кинетина, индолилуксусной, гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей н-оутанол, пропанол, аммиак, вода в объемном соотношении 28:57;5:10.Систему растворителей пропускают восходящим током при подъеме ее на 21 см от линии старта. Разделение фитогормонов на комбинированном адсорбенте происходит за 2,5 ч. Хроматограмму подсушивают Феном и выветривают до исчезновения запаха растворителяДля качественного определения фитогормонов используют комбинированный проявитель, Слой опрыскивают0,005 Е-ным водным раствором Флуоресцеина, сушат 2 мин феном, действуют парами брома, освещают ультрафиолетовым светом. Фитогормоны на таких хроК х 100 (Растворитель: н-бутанол,пропанол,аммиак,45вода 28: 57: 5: 10,об, Е Соединение 50 Кинетин Индолилуксусная кислота 41 Гибберелловая кислотаАбсцизовая кислота 55 51 65 матограммах сильно поглощают ультрафиолетовый свет и принимают темно- фиолетовую окраску.Значения К фитогормонов на комби 40 нированном адсорбенте приведены в таблице. П р и м е р 2. 1 О мл сывороткикрови человека фиксируют жидким азотом и растирают до порошкообразногосостояния, экстрагируют 400 мл подкис.ленного 807,-ного метилового спиртао60 ч при -5 С. После взбалтыванияспиртового экстракта на механическойокачалке при 22 С в течение 3,5 ч снова выдерживают 18 ч при низкой температуре. Экстракт центрифугируют при0 С (5000 об./мин в течение 35 мин),отделяют спиртовой экстракт и осадокразмешивают в 40 мл подкисленного метилового спирта и центрифугируют10 мин при той же температуре,Объединенные спиртовые экстрактыотгоняют в таке воздуха и оставшиеся115 мл водного раствора центрифугируют при 20 С 5000 об./мин в течение20 мин). К центрифугату добавляют120 мл толуола, встряхивают 3 мин идекантируют, Промывку со свежей порцией толуола повторяют еще раз. Доводят реакцию раствора до рН 10 207.-нойИаОН, пропускают через колонку сокисью алюминия и элюпруют 25 мл воды, Белки из 140 мл элюата осаждают15 мл концентрированного раствора уксусно-кислого свинца, центрифугируют15 мин при 5000 об,/мин и к центрифугату добавляют 13 мл 107-ного сульфата натрия.Водный остаток подкисляют до рН2,5 с помощью 5 н.НС 1 (рН растворапроверяют с помощью универсальной индикаторной бумаги) и фракционируют неменее трех раз равными объемами очищенного серного эфира, Эфир удаляют втоке холодного воздуха, а сухой остаток растворяют в 2 мл 967-ногоспирта. Спиртовой раствор фильтруютчерез стеклянную вату и хроматографируют по примеру 1.П р и м е р 3. 30 мл бычьей спермы фиксируют жидким азотом и растирают до порошкообразного состояния,экстрагируют 400 мл подкисленного807-ного метилового спирта 60 ч при-6 С. После взбалтывания спиртовогооэкстракта при 22 С в течение 3,5 чснова выдерживают 18 ч при низкойтемпературе. Экстракт центрифугируютпри 0 С (5000 об,/мин в течение 40 мин)осадок размешивают в 40 мл растворителя и центрифугируют 10 мин при техже условиях.Объединенные спиртовые экстрактыотгоняют в токе воздуха и оставшиесяны как из растительного, так и изживотного сырья в большем количествепо сравнению с известным способом5и значительно с экономить органи -ческие растворители 1 этилацетаттолуол) . Формула изобретения10 Составитель И Тареева Техред В.Кадар Корректор И. Иуска Редактор 11 Гереши Заказ ,042/38 Тираж 776 ПодписноеБНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 11 осква, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие,г. Ужгород, ул. Проектная, 4 с 3 13358120 мл водного раствора центрифугируют при 20"С (5000 об,/мин в течение20 мин), Трижды промывают центрифугатравными объемами толуола, Доводятреакцию раствора до рН 9,5 207-нымраствором ИаОН, пропускают через колонку с окисью алюминия и элюируют25 мл воды.Белки из 140 мл элюата осаждают20 мл концентрированного растворауксусно-кислого свинца, центрифугируют 20 мин при 5000 об./мин и кцентрифугату добавляют 15 мл 107.-ного сульфата натрия, Зодный остаток 15подкисляют до рН 2,25 с помощью 5 н,НС 1. Экстракт доводят до хроматографированпя по примера:1 и 2,Таким образом, предлагаемый способдает возможность выделить фитогормо 20 Способ разделения смеси фитогор" монов по авт,св. Ф 11 б 4598, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и расширения возможностей способа, перед нанесением смеси на адсорбент, экстракт подщелачивают до рН 9-10, добавляют раствор уксусно-кислого свинца, подкисляют до рН 2-2,5 и экстрагируют серным эфиром,