Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАИИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 19 И 4 С 01 И 33/66 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Белорусский научно-исследова-.тельский институт охраны материнстваи детства(56) Руководство по клиническим лабораторным исследованиям,. М., 1964,с. 294,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛОЧНОЙЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ(57) Изобретение относится к медицине, Цель изобретения - повышение точности способа, Смешивают раствор суль.фосалициловой кислоты и исследуемуюбиологическую жидкость и центрифугируют, Супернатант помещают в водянуюбаню, смешивают с рабочим реактивоми нагревают. Полученную смесь смешиваютс раствором параоксидифенила,прогревают, охлаждают и фотометрируют, Количество молочной кислоты в опытнойпробе высчитывают с учетом оптическойплотности эталонной пробы с известнойконцентрацией молочной кислоты.2 табл.Изобретение относится к биологиии медицине и может быть использованов клинической лабораторной диагностике.Цель изобретения - повышение точности способа за счет внесения в супернатант соляно-кислого семикарбазида.Способ осуществляется следующим 10образом,Применяют реактивы; 0,229 моль/л(57) водный раствор сульфосалициловойкислоты; серная кислота для пробы Саваля; 0,500 моль/л (12,5 Ж) водный Збраствор серно-кислой пятиводной меди)", 0,179 моль/л (27) водный растворс.оляно-кислого семикарбазида,Рабочий реактив получают следующимобразом. К 99,0 мл серной кислоты для 20пробы Саваля добавляют 0,6 мл0,500 моль/,л раствора серно-кислоймеди, перемешивают и добавляют 0,4 мл0,179 моль/л раствора соляно-кислогосемпкароазида, Перемешивают и ставят 5ав водяную баню с температурой 70 Сна 30 мин, после чего реактив вынимают из бани и охлаждают до комнатнойтемперагуры,Кроме того, применяют 0,088 моль/л 30(1,5 Е) раствор параоксидифенила в диметилформамиде,В пробирку наливают 0.,4 мл0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты, вносят в нее 0,02 млцельной крови (плазмы крови, сыворотки крови, спинно мозговои жидкости),тщательно перемешивают и через 10 минцентрифугируют в течение 10 мин при3000 об,/мин. 0,3 мл супернатанта переносят в другую пробирку, которую помещают в холодную водяную баню с темопературой воды .5-15 С, после чего внее добавляют 2,6 мл рабочего реактива, тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температуройОводы 70 С в течение 10 мин. Пробиркуохлаждают водопроводной водойцобавляют в нее 0,05 мл 0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно пере мешивают и оставляют при комнатнойтемпературе на 60 мин,Пробу вновь прогревают в водянойобане с температурой воды 70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводнойводой до комнатной температуры и фотометрируют на спектрофотометре при- 570 нм против контроля на реактивы в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм, Контрольную пробу обрабатывают так же, как и опытную, но вместо исследуемой биологической жидкостииспользуют дистиллированную воду в том же объеме,Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты, которую также проводят черезвсю методику, Расчет ведут по формуле этгде С и С - концентрации молочнойоп Ткислоты в опытной иэталонной пробах состветственно,"Е и Е, - оптические плотностиопытной и эталонной пробы соответственно.Повышение точности определения молочной кислоты по предлагаемому способу по сравнению с известным способом подтверждается при экспериментальком исследовании растворов молочной кислоты с концентрациями 0,555;1,110 и 2220 ммоль/л,цельной крови, плазмы крови и с.пинно-мозговой жидкости, результаты которого представлены в табл. 1, Проводят по 5 параллельных определений каждой пробы,Сравнительный анализ результатов статистической обработки величин оптической плотности цветного продукта реакции при определении .молочной кислоты по предлагаемому и известному способам показывает, что в первом случае при большем значении средней арифметической (М) величины средней ошибки средней арифметической (ш) и среднеквадратического отклонения (б ) значительно ниже, чем при определении молочной кислоть по известному способу, что свидетельствует о большей точности предлагаемого способа.П р и и е р 1. Определение молочной кислоты проводят в отдельных пробах цельной крови, плазмы крови,сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости и эталонного раствора молочной кислоты, причем из каждой пробы делают по три параллельных определения и рассчитывали М ш и бВ шестна,ццать пробирок наливают по 0,4 мл 0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты и вносят в пробирки 1-3 по 0,02 мл цельной кро 1335880ви, в пробирки 4-6 0,02 мл плазмыкрови, в пробирки 7-9 0,02 мл сыворотки крови, в пробирки 10-12 Оь 02 млспинно-мозговой жидкости в пробиркиь513-15 0,02 мл эталонного раствора молочной кислоты с концентрацией1 ммоль/л в пробирку 16 0,02 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы),Пробы тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение10 мин при 3000 об/мин. 0,3 мл супернатанта из каждой пробирки переносятв другие пробирки с соответствующиминомерами, которые помещают в водянуюбаню с температурой воды 5-15 Сьпосле чего в них добавльпот по 2 ь 6 млрабочего реактива Гс испо:гьзоваптгм0,6 мл 0,480 моль/л сег,но-кислой пятиводной меди + 0,4 мл 0,170 моль/лсоляно-кислой семикарбазида + сернойкислоты для пробы Саваля до 100),Пробы тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температурой воды /О С в течение 10 мин, после чего охлаждают водопроводной водой, добавляют в них по 0,05 мл0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно перемешивают и остав- ЗОляют при комнатной температуре на60 мин, Затем пробы вновь прогреваютв водяной бане с температурой водыо70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводной водой до комнатной темпера 35туры и фотометрируют опытные и эталонную пробы на спектрофотометре при570 нм против контроля на реактивы.Количество молочной кислоты в опыт-,10ных пробах высчитывают по формуле (1)Получают следующие результаты измерения оптической плотности опытныхи эталонных проб Еоо, = 0,187; ЕСредняя Е= 0,230, По формуле(1) рассчитывают концентрацию молочнойкислоты в опытных пробах0,813 ммоль/л,Соо = 0,800 ммоль/л; С,э = 0,808 ммоль/л.Таким образом, для пробь цельнойкровиДля пробы плазмы крови М = 0,978;п 7 = +0,0063;б = 0,0090.- 1 ь 165 ммоль/л; 1, 156 ммоль/л; 1,148 ммоль/л,оп 7оп 8 Соо "ь Для пробы сыворотки крови 1 г 6.+0,0060;Оь 0085.1,595,1 моль/л,1,578 ммоль/л;- 1,58 ммоль/л.бы спинно-мозговой жидкости ш Со,о Соо н Соп ьг Для про Г 1 = 1,586;тп = +Оь 0060; ть О 008 э. С = 0,818 ммоль/л; В тех же образцах цельной крови, плазмы крови, сыворотки крови и спин- но-мозговой жидкости (по три параллельных определения из каждой пробы) способом, описанным в примере 1, но с использовавием рабочего реактива с максимальными значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида солянокислого (0,6 мл 0,520 моль/л серко-кислой пятиводной меди + 0,4 мл С,201 моль/л солянокислого семикарбазида + серная кислота для пробы Саваля до 100,0 мл), определяют кочичество молочной кислоПолучают следующие практические результаты измерения оптической плотности опытных и эталонной проб: Ео ь" ь оо 2 ь 8 ь ЕаоэЕ, (сыворотка крови) = 0,268; Е 8По формуле (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытных пробах1335880 Соп 2 = 0,809 ммоль/лф Спп = 0,805 ммоль/л. Таким образом, для пробы цельнойкрови 0,810;+Оь 00470,0066. 10 0,965 ммоль/л;0,974 ммоль/л;0,978 ммоль/л. Оп 4СопС= 15 ммоль/л; ммоль/л; ммоль/л. 1,160 1,169 - 1,15,1 ппт опт апп 20 Для пробы сыворотки крови М = 1,160,тп = -.0,0063;Б = 0,009,25 1,588 ммоль/л;1,575 ммоль/л;0,575 ммоль/л,Спп=С,=оп Для пробы спинно-мозговой жидкости М = 1,579," ш = +0,0053 Р Й = 0,0075,0,17-0,20 Результаты определения молочной 35кислоты в одних и тех же пробах биолоДо 100 Таблица 1 Оптическая плотность по способу Исследуемыйматериал По предлагаемому способу+0,00110,0024 091 ФО 0,200 0,174 т = +0,01155 = 0,0257 Для пробы плазмы кровиМ = 0;972;тп = +00047;й = 0,0066,гических жидкостей с использованием рабочего реактива с минимальными и максимальными значениями концентраций серно-кислой пятиводной меди и солянокислого семикарбазида представлены в табл, 2,Сравнительный анализ с использованием статистическсй обработки не выявил различий между ними. Формула изобретения Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях путем добавления в пробу химического реактива, центрифугирования полученной смеси с последующим внесением в супернатант раствора серно-кислой пяти- водной меди и серной кислоты. для пробы Саваля, нагревания, а затем охлаждения и добавления в пробу раствора параоксидиФенила, после чего проводят спектроотометрическое измерение, о т л и ч а ю ш, и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, в супернатант дополнительно вносят соляно-кислый семикарбазид в смеси с реактивами при следующем соотношении компонентов, моль/л:Серно-кислая пятиводная медь 0,48-0,52Семикарбазид солянокислыйСерная кислота дляпробы Саваля По известному способу1335880 Продолжение табл,Оптическая плотность по способу Исследуемыйматериал По предлагаемому способуПо известному способу 0,512 М = 0,514 0,330 0,370 0,354 0,302 0,333 То же,2,220 ммоль/л+0,00260,0058 0,0322 Таблица 2 Концентрация молочной кислоты(Мтп) при использовании рабочего реактива,ммоль/л,с значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида соляно-кислого Биологическая жидПроба кость