Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый для культивирования вирусов

(19) (1 1 А 1 17 С 12 11 5/00, 7/О ьЙ(" ,13 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 088,8)видетельство СССР12 И 7/00, 1979. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Государственный научно-исследовательскийинститут стандартизации и контролямедицинских биологических препаратоим, Л.А.Тарасевича(54) ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК КОЖИ ИМЬШЗЦ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМЫИДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ(57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для накопления вирусной биомассы и приготовления вакцин. Цельюизобретения является получение нового диплоидного штамма кожи и мьппцэмбриона человека, используемого длякультивирования вирусов. Штамм полуают трипсинизацией кожно-мьппечных оскутов 8-недельного эмбриона челоека и адаптацией полученных клеток стабильным условиям культивирования. Штамм обозначают М, он хранится в Коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером 2-3-2. Время жизни штамма Мвне организма составляет 70 пассажей. Среднее число популяционных удвоений на 14-16 пассажах составляет 1,6 при использовании сыворотки крупного рогатого скота и 1,57 при использовании сыворотки телят на уровне 25-28 пассажей 1,88 и 1,71. на уровне 40 пассажа 1,8 и 1,72 соответственно. На уровнях 12, 20, 32 и 40 пассажей установлено, что диплоидный набор хромосом имеют 89,7; 92,0; 89,7 и 82,0% клеток соответственно. Штамм не контаминирован грибами, бактериями, микоплазмой и онкогенными вирусами. Титры вирусов при культивировании на клетках штамма Мимеют следующие значения: вирус полиомиелита, штамм Сэбина, типы 1, 11, 111, 7,71 18 БОЕ/мл, 7,75 18 БОЕ/мл и 7,65 1 я БОЕ/мл соответственно. Титр вируса ЕСНОравен 10ТЦД .Титр риновируса равен 7 10 ТЦД .7Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано длянакопления вирусной биомассы и приготовления вакцин.Цель изобретения - получение нового диплоидного штамма кожи и мышцэмбриона человека, используемого длякультивирования вирусов и обладающе го большей пролиферативной активнос 10тью по сравнению с известным.Штамм получают следующим образом,Кожно-мышечные лоскуты 8-недельного эмбриона, выделенного путемаборта от здоровой женщины 32 лет,в анамнезе которой нет онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий, атакже гепатита и туберкулеза, промывают физиологическим раствором дляудаления крови, измельчают ножницамии проводят щадящую трипсинизацию,Далее клетки ресуспендируют в средеИгла МЕМ с 10 Е-ной сывороткой крупного рогатого скота (СКРС) и эксплан тируют в 6 полуторалитровых матрасахс концентрацией клеток 8 10 в 1 мл.Сосуды с клетками инкубируют при37 С. В первичной культуре монослойформируется в течение 5 сут, первыйпассаж проводят на 6 сут, а все последующие - проводят по четкому графику 2 раза в неделю, так что интервал между пересевами клеток постоян сно составляет 3 и 4 сут,Полученный штамм, обладающий морфологической и культуральной стабильностью, обозначают М. ШтаммМхранится в Коллекции клеточныхкультур Института вирусологииим, Д.И.Ивановского под номером 2-3-240и характеризуется следующими признаками.Морфологические признаки.В фазе становления культура характеризуется неоднородностью клеточного состава и представлена фибробластоподобными и эпителиоподобнымиклетками, К 4-5 пассажу культура становится мономорфной и состоит из фибробластоподобных клеток. Лишь .с вступлением в фазу старения вновь отмечаются клетки различной морфологии,появляются полигональные и гипертрофированные клетки.55При обследовании гистологическихпрепаратов культур в фазе активногороста, окрашенных гематоксилин-эозином, выявляют ядро овальной или удлиненной формы, ориентированное вдольдлинной оси клеток, хроматин мелкозернистый В цитоплазме и ядре специфических включений не наблюдается.Электронномикроскопическое изучение штамма Мна уровне 28 пассажапоказывает, чтоклетки представляютсобой Фибробластнье образования, имеющие характерное для соматических клеток позвоночных субмикроскопическоестроение, В клетках хорошо развитасеть эндоплазматического ретикулума,состоящего из ппоских или расширенных цистерн, усеянных многочисленными рибосомами. Удлиненные, вытянутыевдоль длинной оси клеток, ядра содержат одно, реже два, ядрышка и диффузный хроматин. Комплекс Гольджи представлен системой плоских цистерн имногочисленными мелкими везикулами.Округлые или овальные митохондрии;имеют характерные для этого органоида строение. Матрикс митохондрий -более электронноплотный по сравнениюс гиалоплазмойВ цитоплазме клеток.липидные капли, лизосомоподобныеструктуры, равноразмерные вакуоли.Клеточная поверхность относительноровная, без многочисленных микроворсинок,Биологические признаки.Время жизни штамма Мвне организма составляет 70 пассажей и складывается из трех фаз: становленияна уровнях 1-3 пассажей, активногороста - на уровнях 4-39 пассажей истарения - на уровнях 40-70 пассажей,На уровнях 14, 15 и 16 пассажейчисло популяционных удвоений составляет 1,61;1,68; 1,5 соответственнопри использовании сыворотки крупногорогатого скота и 1,58; 1,6; 1,54 соответственно при использовании сыворотки телят.Средняя для 14-16 пассажей в первом случае составляет 1,6, во втором - 1,57.Время удвоения популяции при использовании обоих видов сыворотки55 ч.На уровнях 25, 27, 28 пассажейчисло популяционных удвоений составляет 1,64; 1,82; 2,2 соответственно,с СКРС, а с сывороткой телят - 2,2;1,57; 1,37. (при средних - 1,88 и1,71), время удвоения популяции 48и 53 ч соответственно, 1317021На уровне 40 пассажа число популяционных удвоений (результаты представлены в той же последовательности) составляет 1,72 и 1,8, а времяудвоения популяции 56 и 53 ч.На уровне 50 пассажа число популяционных удвоений при использованииобоих видов сыворотки составляет0,76, а время удвоения популяции 91 ч.При субкультинировании клетки отстекла отделяют 0,25% раствором трипсина, Коэффициент рассева клеток нфазе активного роста составляет1:2 - :3.Среда культивирования: среда Игла15МЕМ с 10% СКРС или сыворотки телят.Кариологические признаки.При анализе 4000 метафаз по1000 метафаз на уровнях 12, 20, 32,40 пассажей, установлено, что диплоидный набор хромосом имеют 89,7;92,0; 89,7; 82,0% метафаз соответственно, Полиплоидные метафазы составляют 1,0; 2,3; 1,7; 1,6%, гипоплоидные 9,2; 5,3; 6,9; 4,7%, гиперплоидные - 0,1; 0,4; 0,2; 0,1%, разрывы - 0,3; 0,5; 0,2; 0,2%, пробелы - 1,7; 0,5; 1,3; 0,3% - в той жепоследовательности.Сведения о контаминации штамма,ЗОПри обследовании клеток штаммаМна стерильность (наличие грибов,бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровнях 10,20, 24, 30, 33, 40 и 42 пассажей,При исследовании культуральныхжидкостей и самих клеток на уровнях10, 20, 30 и 40 пассажей в чувствительных клеточньгл системах, а такжев реакциях гемадсорбции не отмечено40наличие вирусов - контаминатов,1 При обследовании клеток штаммаМна тех же уровнях пассажей вопытах на взрослых и сосунках белыхмьппей, кроликах, морских свинках,куриных эмбрионах,иммунодепрессированных мьппах линии СВА постороннихагентов не выявлено.Онкогенная активность клетокштамма Мне выявлена и в опытахп чСго в органной культуре куриного эмбриона.Изозимный спектр. юИзучение изоферментов в клеткахлинии Мвыявляет энзимограмму человека и Г 6 ФДГ медленного типа,Криоконсервация клеток,Клетки штамма Мсохраняют жизнеспособность порядка 70% при консервировании в жидком азоте, Созданбанк отконтролированных посевныхклеток на уровне - 9 пассажа в количестве 157 ампул (по 6 миллионовклеток н каждой ампуле),Чувствительность к вирусам,Штамм Мчувствителен к заражению накцинными штаммами Сэбина вируса полиомиелита, Так титр типа 1на уровне 16 пассажа равен 7,74 1 яБОЕ/мл, а на уровне 20 пассажа -7,71, соответствующие показатели дляПтипа 7,60 и 7,75, а для 111 типа -7,63 и 7,65.Штамм Мчувствителен также кзаражению вирусами из группы ЕСНО,Коксаки, рино. В частности, титр вируса ЕСНОранен 10Т 11 Д, а Рино - 7 х 0 Т 1 1 Д.Использование штамма Миллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, В культуральный сосуд с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека Мна уровне 19 пассажа вводят 0,25%-ный раст-.о нор трипсина, подогретого до 37 С. Через 7-10 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37 С на 2-3 мин, После этого в него вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхи-. ванием, заканчивают процесс отделения клеток от стекла. Затем в клеточную взвесь добавляют среду роста - среда Игла МЕМ с 10% СКРС, и разливают на два сосуда, Эти культуры 20 пассажа инкубируют при 37 С н течение 3 сут до момента формирования плотного слоя1При заражении вирусом полиомиелита, штаммом Сэбина, типом 1 среду из культуральных сосудов сливают, клетки один раз промывают рабочим раствором Эрла и вводят вируссодержащую среду из расчета не более 1 БОЕ на клетку, В качестве поддерживающей среды используют 0,3%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Эрла, рЬ 7,5. Культуры инкубируют при 34 С. Сбор вируса проводят на 3-4 сут, Вируссодержащую жидкость хранят прио-20 , Титр вируса определяют по методу образования бляшек при заражении первичной культуры клеток почек африканских зеленых мартьппек. Титр вируса равен 7,71 1 я БОЕ/мл.1317021 Формула изобретения Составитель М,СероваРедактор И.Сегляник Техред М,Ходанич Корректор С,Шекмар Заказ 2394/23 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, )К, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р 2, Клетки штамма Мна уровне 20 пассажа получают и заражают вирусом полиомиелиташтаммом Сэбина, типом 11 по способу, описанному в примере .1, При этом титр 5 вируса составляет 7,75 1 я БОЕ/мл.П р и м е р 3. Клетки штамма Мна уровне 20 пассажа пол в .ают и заражают вирусом полиомиелита, штаммом Сэбина, типом 111 по способу, спи санному в примере 1. При этом титр вируса равен 7,65 1 я БОЕ/мл.П р и м е р 4, Клетки штамма Мна уровне 25 пассажа получают, как указано в примере 1, только используют клетки 24 пассажа и заражают вирусом ЕСНОиз расчета 1 БОЕ нао клетку. Культуры инкубируют при 37 С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют7,его титр, который равен 10 ТЦД .П р и м е р 5, Клетки линии Мна уровне 25 пассажа получают, как указано в примере 4, и заражают рино вирусом из расчета 2-3 БОЕ на 1 клетку, Культуры инкубируют при 37 С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют его титр, который равен 7 х 10 ТЦД Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека У 2-3-2 (Коллекция клеточных культур Института вирусологии им. Д,И,Ивановского), используемый для культивирования вирусов,