Штамм продуцент уреазы

(59 4 С 12 И 9/78, 1/20//С 12 Б 9/7 С 12 Н 1:44 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СТОУ СВИ ТОРСН АРВОРНУРЕАЗН аргорйу- Цент- микроенетика", 3261) иСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(56) Авторское свидетельство ССФ 675986, кл. С 12 Б 15/00, 197Авторское свидетельство СССРР 990813, кл, С 2 И 15/00, 198(54) Т 1 СЦБ (57) 1 сиз ральн орган колле проду ТАММ ЯТАРНУ 1 ОСОССЦБ Б1.10.к.-ПРОДУЦЕНТ У тамм Б 1 арЬу 1 ососсцз з1. 10.ч. (коллекция го музея промышленных змов института иВНИИг ционный номер ЦМПМ В- ент уреазы,Изобретение относится к микробиологической промьппленнасти, а именнок получению нового штамма, используемого дпя получения фермента уреазы.Целью изобретения является получение нового штамма - продуцентауреазы - с более высокой и стабильной активностью в условиях глубинного культивирования.Штамм Б 1 арйу 1 асассия яаргар 1 у 1 -сцз 1-1.10,ч. получен путем целевого селекционного отбора наиболееактивных вариантов Б 1 арЬУ 1 асассдязаргорйу 1 спз ,-1.10. Установлено,что в пределах морфолагически нераз-ччимых колоний вариантов наблюдается определенный размах спонтаннойизменчивости по признакам биасинтетической активности, Принимая вавнимание возможность стабильного образования уреаэы на "верхних пределах" в результате спонтанной биосинтетической способности образованияэтого фермента, проводили целенаправленное более детальное изучениеестественной изменчивости Б,арЬу 1 асассиз заргорйу 1 сця 1 -1,10,С целью отбора возможных болееактивных вариантов производили рас -сев исходной бактериальной суспензии Б 1 арйу 1 асоссцяяаргарЫу 1 хс;я.о.10 на агаризованную среду вчапках Петри. Культура оставаласьстабильной по способности образовывать характерные ей колонии диаметром 0,5-1,2 мм. Количественную оценку накопления уреазы исследовали вклетках, выращенных глубинным способом при 37 С в течение 1 чч.Активность вариантов колебалась от16 до 22 ед/мг сухих клеток. В результате дальнейшей селекционной работы был отобран вариайт Б+арЪУ 1 ососсцз заргорйусця ь.10.ч. ста-.бильно сохраняющий высокий уровеньбиосинтеза уреазы при многократныхпересевах, с активностью 21,4 едмгсухих клеток. Оптимальный биосинтезуреазы в клетках продуцента происходил при рН среды 50-5,2, в та времякак оптимальное значение данной ве"личины в клетках исходного штаммаравно 6,0-6,5. Более высокий рН благоприятствует поддержанию стерильности во время культивирования.Штамм Б 1 ьрЬу 1 ососспз заргорЬуЬ 3. -сиз е,10.ч,- продуцент уреазы хранится в центральном музее культурмикроорганизмов институтаВНИИгенетика пад коллекционным номером ПМПМВ,Морфологические признаки.Шаровидные бактерии. Ва время логарифмической Йаэы раста клетки чащевсего образуют пары и тетрады, а позднее, как правило, располагаютсяпоодиночке и нередко создают скопления в виде гроздьев, неподвижны,спор не образуют. Величина клетокадносуточнай культуры на МПА 0,51,2 мк в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиповым синим, грампалажительны.Культуральна-физиологические признаки.На МПА после 24 ч роста при 37 Собразуют калении диаметром 0,5-1,2 мм.Колонии серовато-белые непрозрачныегладкие блестящие с правильными краями. После 48-72 ч в центре колонийобразуют визуально почти неразличимую выпуклость зеленоватого оттенка.В МПБ вначале образуют мутность, которая позднее осаждается на дна пробирки, Среда становится и остаетсяпрозрачной На поверхности картофеля не растет.Штамм является факультативныманаэрабом с оптимальной температуройраста 37 С. ".рахмал не гидралиэует,Молока не пептанизирует. телятинуне разжижает. На среде с минеральнымисточником азота не растет, Нитратывосстанавливает в нитриты. Ассимилирует углеводы: мальтазу, глюкозу,фруктоэу, сахароэу, лактозу, а такжеглицерин, Не усваивает арабиназу,ксилаэу, сорбит, рамнаэу, маннит,дульцит и инаэит. Устойчив к лизоциму, Содержание Г+Ц оснований в ДНКсоставляет 30,5-35,0 мол.7. Культурахранится в пробирках на агаризован-.най среде пад вазелиновым маслом ив лиофилизированном состоянии,П р и м е р, Для хранения и выращивания штамма Б 1 арйуХососспя яаргорЬуЫсцз .-1.10.ч. используется среда следующего состава, г/л: натрий хлористый 5-0; натрий азотнокислый 2,5; калий фосфарнакислый одназаме- щенный 2-0; ферментативный гидрализат дрожжей 10,0; кукурузный экст-ракт 400.3 12Ферментативный гидролизат дрожжей,кукурузный экстракт и минеральныесоли суспендируют в 1/5 объеме водыот конечного объема среды, ЗОБ-нымраствором едкого натра доводят дорН 5,0 и прогревают при 90 С в теочение 30 мин, После охлаждения раствора до комнатной температуры с целью удаления нерастворимых частиццентрифугируют при 400 об/мин в течение 40 мин, Недостаточную жидкостьводой доводят до конечного объемасреды. Стерилизацию полученного раствора проводят при 135 С 40 мин.Для получения посевного материала культуру, хранимую в пробиркахсо скошенным агаром или под слоемстерильного вазелинового масла при4 С, высевали на чашки Петри и теромостатировали в течение 24 ч прио37 С. Выросшую культуру с чашек пересевали в колбы объемом 750 мл,,содержащие 1 ОО мл среды, и выращивали на качалке (180 об/мин) при 37 Св течение 4-5 ч. Инокулят засевали гв количестве 10 бактериальных клеток на 1 мл питательной среды.Культуру в лабораторных условияхвыращивали в колбах объемом 750 млсо 100 мл среды на качалке (180 об/мин)при 37 С в течение 16 ч,Культивирование штамма Б 1 арЬу 1 ососсця яаргорЬуспя ь,10,ч. проводили также в 20- и 250-литровыхферментерах с рабочим объемом 1 Оили 100 л питательной среды соответо,ственно при 37 С в течение 16 ч. Питательную среду применяли такую же,как и в лабораторных условиях. Посевным материалом служили клетки,предварительно выращенные в колбахна качалке в течение 12-16 ч. Фер-иентацию в 20-литровых ферментерахпроизводили с подачей воздуха 8 л/мини перемешиванием среды при 120 об/минВыращивание в 250-дитровых ферментерах проводили при аэрации 8 м /ч.эВ обоих случаях в качестве пеногасителя испольэовали силикон (5-6 мл//10 л среды). Значения рН 5,1 в процессе роста не поддерживали. Каждые2 ч определяли уреазную активность,начиная с 4-го часа культивированиядо конца ферментации (14-16-го часа). Изменение уреазной активностив опытах производили в сухих клетках, обработанных охлажденным ацето ном, Из веса сухих клеток рассчиты 70172 5 10 5 20 25 30 35 40 45 50 вали уровень уреазной активности на1 мл культуральной жидкости. Активность уреазы определяли колориметрическим методом с использованием реагента Несслера. За единицу уреазнойактивности принимали такое количество фермента, в результате действиякоторого на субстрат выдепяетсяо1 мкмоль аммиака за 1 мин при 30 С,Результаты испытаний предлагаемого и известного штаммов приведеныв табл. 1,Изучение динамики роста и биосинтеза уреазы в клетках нового продуцента, выращенного глубинным способом, показало, что максимальная уреазная активность наблюдается после10 ч культивирования и не меняетсядо 16-го часа роста.Из табл. 1 видно, что величинымаксимальной активности уреазы и веса биомассы клеток ЯСарЬу 1 ососсцяяаргорЬу 5.сия 1 .10.ч., выращенных как в колбах, так и ферментерах прак тически одинаковы. В,то жевремя активность уреазы в 1 мп культуральной жидкости и в 1 мг сухих клеток нового штамма приблизительно на 543 превышает активность фермента в исходной культуре. Кроме того, предлагаемый штамм Б 1 арЬу 1 ососсия яаргорЬу.сия 1 1.10.ч. максимум уреазы накапливает при росте в кислой зоне при рН 5,0-5,2, что облегчает поддержание стерильности во время ферментации.В конце ферментации биомассу от культуральной жидкости отделяли це - г нтрифугированием на проточной центрифуге Спри 12000 об/мин. Клет ки продуцента разрушали механически, используя стеклянные шарики диаметром 0,16-0,3 мм. Полученный экстракт клеток центрифугировали при 14000 об/мин. В надосадочной жид- . кости измеряли уреазную активность и концентрацию белка. Белок определяли методом Лоури. Ферментный препарат уреазы из клеточного экстрак та получали путем двукратного пере- осаждения 3 объемами этилового спирта по отношению к 1 объему экстракта. Полученные данные представяены в табл. 2. Как видно из табл, 2, способностьк репродукции клеток как нового, так 1и исходного штаммов одинакова. Одна1270172 тивность в сухом ферментном препарате по сравнению с исходным штамТаблица Коли -Уреазная активность СпособкультиВес сухих кле Продуцент чество опытов ед/: г сухих клеяирования ток жидкости БС, яаргорйуСосця.) 1,10 7,7 77,0 ф 3,0 90,05,6 280,03,0 ВНИИПИ Заказ 6201/21 Тираж 490 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3ко использование культуры ЯСар 1 у 1 ососсия яаргорйуСсця ь.О.ч. позволяет на 25% повысить уреазную акВ 10-литровых ферментерах ток на1 мл культуральной в клеточном экстракте ед/мп культуральнойжидкос ги