Способ определения естественной киллерной активности клеток

.Я 2 СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ РЕСПУБЛИК 5 0 01 М 33/53 ЗОБРЕТЕНИ И ТЕЛ ЬСТ ТОРСКОМ(71) Киргизский государственнский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ КИЛЛЕРНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ныи медици Изобименнопользоваской и эхарактерния имм цине, а ыть ис- лийичеины для ся к мед и может областях ой медиц нального етение относит иммунологии, о в различных периментальн стики функцио нной системы, изобретения -состоя рощение спосооб зом.К 10 мл гепаринизировьнной крови из вены (25 ед/мл) добавляют 1 мл 10-ной желатины и инкубируют 35 мин при 37 С до оседания эритроцитов. Взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколла-верографина плотностью 1,077 и центрифугируют 45 мин при 450 д, Отсасывают интерфазу(мононуклеары), дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют в полной питательной среде (ППС), состоящей из среды КРМ 1/1640 с добавлением 1-.глютамина (300 мг/мл), 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 0,08 мг/мл гентамицина, Клетки разводят до концентрации 2 10 /мл, В пять лунок пластиковых6 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР соб осуществляют следу(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения естественной киллерной активности клеток. Цель изобретения - упрощение способа, У обследованного берут кровь, выделяют лимфоциты, инкубируют их с лимфоцитами, обработанными фитогемагглютинином, и по уровню включения ЗН-тимидина выявляют естественную киллярную активность. По сравнению с известным способом упрощается методика постановки исследования, так как отпадает необходимость в введении серийных пассажей перевиваемых культур. плоскодонных планшетов помещают по 0,1 мл взвеси клеток, В две лунки добавляют по 0,1 мл фитогепагглютинина (Ф ГА) в разведении 1:100 на ППС, в остальные лунки - 0,1 мл ППС. Планшеты инкубируют 48 ч при 37 С в атмосфере 50-ного углекислого газа. Затем планшеты центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают и отмывают . клетки один раз средой 199, Во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС, клетки ресуспендируют,Культивированные клетки смешивают следующим образом.1 (опыт), К нестимулированным лимфоцитам добавляют стимулированные ФГА- лимфоциты (бласты);2 (контроль 1). К стимулированным лимфоцитам добавляют 0,1 мл ППС;3 (контроль 2), К нестимулированным лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты.Планшеты инкубируют еще 18 ч, после чего во все лунки добавляют Н-тимидин (1 мкм Со), инкубируют 4 ч, клетки переносятна фильтры и после общепринятой обрабо1730592 тки определяют уровнеь радиоактивностина бета-счетчике.Расчет результатов проводят по формуле 45 50 Составитель В,ЛитовченкоТехред М.Моргентал Корректор М,Бланар Редактор М,Петрова Заказ 1511 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 К 1 - ОК 1 К 2где О - число импульсов в опытной пробе;К 1 - число импульсов в пером контроле;К 2 - число импульсов во втором контроле.П риме р 1. Больной Г.,36 лет, Диагноз: инфильтративный туберкулез легких, БК+.20,03.89, Из вены больного,взято 10 мл крови, добавлено 250 ед, гепарина и 1 мл 10%-ной желатины, Кровь инкубируют 35 мин, затем взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколл-верографина и центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин, Отсасывают интерфазу, дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют клетки в полной питательной среде (ППС), Клетки разводят до концентрации 2 106/мл. В пять лунок пластикового планшета помещают по 0,1 мл взвеси клеток. В две лунки добавляют по 0,1 мл ФГА (ООсо Р) в разведении 1;100, в остальные лунки - по 0,1 мл ППС. Планшет инкубируют 48 ч при 37 С в атмосфере 5%- ного углкислого газа. Планшет отцентрифугировали. Затем клетки отмывают один раз средой 199, во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС и клетки ресуспендируют. Далее проводят смешивание клеток; к нестимулированным лимфоцитам добавляют стимулированные лимфоциТы (бласты) - опыт, к стимулированным лимфоцитам добавляют 0,1 мл ППС (контроль 1), к нестимулированным лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты (контроль 2). Планшет инкубируют еще 18 ч при тех же условиях. За 4 ч до окончания инкубации во все лунки вносят 1 мкКи Н-тимидина. Ресуспендированную клеточную взвесь переносят на бумажные фильтры размером 2 х 2 см, Фильтры высушивают в течение 1 сут прикомнатной температуре, помещают в стек 5 лянный сосуд и отмывают дважды, 0,9%ным раствором хлористого натрия по 5 мини 5%-ной трихлоруксусной кислотой в течение 1 сут при 4 С, Затем промывают ещедвукратно 5%-ной трихлоруксусной кисло 10 той по 5 мин и фиксируют 96-ным спиртом 2мин, высушивают, помещают в 5 мл сцинтиллятора (РРО-РОРОР-толуол) и просчитывают на жидкостном сцинтилляционномспектрофотометре (1 КВ, Швеция). Резуль 15 таты регистрируют по числу импульсов в 1мин,Получены следующие показатели: опыт- 6728; контроль 1 - 15713; контроль 2 -5127,20 15713 - 6728Расет 15713 - 5127 100 = 84,88 %,Предлагаемый способ прост, так как отпадает необходимость в постоянных пересевах клеток, как это. делается в известном25 способе поддерживания жизнеспособностиопухолевых линий клеток,В связи с этим уменьшается время выполнения анализа и исключается использование полных питательных сред, что дает30 значительный зкономический эффект.Формула изобретенияСпособ определения естественной киллерной активности клеток, включающий инкубацию лимфоцитов с мечеными35 клетками-мишенями с последующим определением уровня радиоактивности, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощенияспособа, в качестве клеток-мишеней используют лимфоциты, обработанные фитоге 40 магглютинином, а естественную киллернуюактивность определяют по уровню включениярадиоактивного меченого Н-тимидина.з