Способ получения полии олигодезоксирибонуклеотидов

СООЭ СОВЕТСНИКСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН И И) 4 С о НИ 13,.,. ЬИЪЯИОТЕт ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ С ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ ПИСАНИЕ ИЭОБ ВТОРСНОМЪ СИИ(56) Во 11 цв Г.1. 1 гоеп 1 яег Е. Лапеда И, Ро 1 удеохуадеп 11 с асИ. В 1 осЬев, 51.1964, 835-859.,Науез Г,М. МдйсЬе 11 7.Е., Кай 1 НГ К-Ь. И 111 авв Р,Ь. 1 псогрогазопеНдс 1 епсу оЕ зва 11 о 1 з 8 о -5 -пис 1 еоСИев 1 пдСдайогв 1 п СЬе Сегвдпа 1деохугЬопцс 1 еойЫе йгапвГегазе геас"Иоп. ВъосЬев. 5. 1966, 3625-3629.ВоПиш Г.Е. ВозупйЬевдв ро 1 удеохупис 1 еогЫев, Ргоседцге п пцс 1 исасй гезеагсЬ ед. СапСоп 1 О.Ь. апдВатаев 0.К. Нем Еог 1, 1966, .577"583,(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛКИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ в томчисле и радиоактивномеченных, путемфермеитативного синтеза иэ соответсвующих дезоксинуклеозид -трифосфатов в какодилатном буфере в присутст- вии ионов двухвалентных металлов, фермента терминальной деэоксинуклеотидилтрансферазы (ДНТФ-азы) из тимуса, инициатора и БН-реагентов при 35-37 Со в течение 12-24 ч с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и расширения ассортимента целевых . продуктов, используют ДНТФ-аэу, иммо" билизованную на сефарозе, активированной ВгСЯ, в концентрации 39,0 - 4 1,0 мг/кп, а синтез ведут в Оа-какодилатном буфере, рН 7,0-7,5, в присутствии ионов М 8 ф в случае синтеза на основе пуринов и Со в случае синтеза на основе пиримидинов.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что хроматографичес" кую очистку продуктов проводят на биогеле А,5 т, а элюацию осуществляй(д А). 1. Получение поли В реакционную смесь, содержащую 0,2 моль/л Ба-какодилата, рН 7,2, 8 ммоль/л ИяС 1, 1 ммоль/л д АХФ, 4,5 мкмоль/л олиго (ЙА). 6 и 1 ммоль/л 2-меркаптоэтанола в 20 ил, добавляют 2642 единиц активности ДНТФ-азы (800,мг), Реакционную смесь перемешивают при 37 в течение 22 ч. Затем отделяют фермент фильтрацией и промывают его на фильтре 5 мл 1 И МаС 1, а в объединенный фильтрат добавляют 1,6 мл О, 1 И ЗДТА, Суммар" ная оптическая плотность реакцион" ной смеси до синтеза 321 о.е. ( % 259 нм), после обработки-. 227 о.е. ( я 259 нм), за 321 о.е. ( я 259 нм), после обработки - 227 о,е. (9 259 нм), Фильтрат упаривают до объема 3 мл при 37 С и хроматографируют на колон" ке 1,6 х 100 см с биогелем А,5 т, уравновешенным водой, прн 6 С - 8 С,е элюируя водой со скоростью 30-40 мл/ч. Выделяют два пика: 1 (поли (ЙА),где и.50-700) - 135 о,е. (Яме, 257 нм, весовая экстинация16,3 о.е./мг при рН 7,0); 11 (исход"ный мономер) " 80 о,е. ( Я 259 нм)П р и и е р 2. Получение поли(дС)у. и 1 ммоль/л СоС 1 (вместо Изобретение относится к биохимии, а именно к усовершенствованному способу получения поли- и олигодезоксинуклеотидов путем ферментатнвного синтеза.Получаемые препараты могут быть испОльзованы для работ в области мо" лекулярной биологии, например, в качестве матриц и инициаторов в систе" мах ДНК-полимеразы, РНК-полимераэы и обратной транскриптазы, а также в ра" ботах по генной инженерии, например при синтезе регуляторной части гена. Кроме того, они могут быть использованы в качестве моделей природной ДНК при изучении ее физико"химических свойств.Цель изобретения - упрощение способа и расширение ассортимента целе" вых продуктов эа счет использования иммобилизованного фермента в определенных параметрах. 5 Ю 15 26 25 ЗО 35 40 5 2хлористого магния), В реакции применяют 2080 ед. активности иммобилизованной ДНТФ-аэы (800 иг). Суммарная оптическая плотность реакционной смеси до синтеза 470 о.е; ( 3 272 нм), после обработки - 44 1 о.е. ( 3 = щ 272 нм), При хроматографии выделяют два пика: 1 (поли ИЦ), п50- 120) - 135 о.е(9 мс= 274 нме ве совая экстинация 17,6 о.е./мг при рН 7,0); 11 (исходный мономер) 239 о.е. (9272 нм).П р и м е р 3. Получение поли (с 1 т) .Препарат поли ИТ) получают ана" логично примеру 2, исходя из 3 ммоль/л с 1 ТТФ, 9 мкмоль/л олиго ЙТ). т и используя 1680 ед. активности иммобилиэованной ДНТФ-азы (800 мг). Суммарная оптическая плотность реакционной смеси до реакции о.е. ( щ 267 нм), после обработки 4950 о.е, ( = 267 нм), При хроматографии выделяют: 1 (поли (сТ), и = 50-700) - 251 о.е, И мд, 264 нм, весовая экстинация 17,7 о.е./мг при, рН 7,0), 11 (исходный мономер) 172 о.е. (= 267 нм) .П р и м е р 4, Получение поли (да) .Препарат поли (Й 6) получают по ме" тодике примера 1, исходя иэ 0,5 имоль/л й СТР, б мкмоль/л олиго (об), и используя 1600 ед. активнос" ти иммобилизованной ДНТФ-аэы (800 мг). Суммарная оптическая плотность реакционной смеси до синтеза " 145 о,е. (% = 252 нм), после обработки - 125 о.е, (Я = 252 нм).Перед гель-фильтрацией на биогеле А,5,ш проводят осаждение продукта спиртом, для этого в фильтрат добавляют БаС 1 до концентрации 0,5 И и осаждают полимер двумя объемами 963-ного этанола. Осадок удаляют центрифугированием в течение 40 мин при 11000 об/мин. Супернатант сливают, а осадок растворяют в 2 мл воды и хроматографируют как в примере 1, Йо" лучают два пика: 1 (поли И 6)я, и20-700) " 32 о,е. (и253 нм,весовая экстииация 12 о,е./мг при рН 7,0; 11 (мономер) " 8 о.е. (Ъ щ252 ам).П р и и е р 5, Получение д (6 АТЦА)А, Олигоде 9 оксинуклеотид получают по методике примера 1, используя в качестве инициатора 50 мкмоль/л д(ЖТОА) и 500 ед. активности иммобн- пе хроматографии выделяют: 1 лизованной ДНТФ-азы (120 мг). Суммар- а (СЛАТТС) 6, - 37 о.е. (9ная оптическая плотность реакционной = 252 нм), 1 (исходной мономер) смеси до синтеза - 56 о.е. ( =259 нм),18 о.е. (9 252 нм) .после обработки Зб о.е. ( 3 =259 нм).П р и и е р 7, Получение радиоПри хроматографии выделяют: 1 активномеченых полидеэоксинуклеоти(а/6 АТЯА/Л, ) - 19 о,е. (% -259 нм), дов.11 исходный а (МТЮЗА) - 42 о.е. (%- Препараты полидезоксинуклеотидов,259 нм). меченных тритием,поли (а/8 - фН/А), П р и м е, р 6. Получение 1 О поли (а/8- Н/С),поли (а/5-.Н/С), а (ВААттс) а, поли (д/метил- Н/Т), получают анало"гично соответствующим нерадиоактивнймПрепарат олигодеэоксинуклеотида полидеэоксинуклеотидам (примеры 1"4), получают аналогично методике приме- но в качестве субстратов используют ра 5, исходя из 1 ммоль/л а ЯТР, ц а/8-Н/АТР, а/8-Н/СТР, а/5-Н/СТР, 100 ммоль/л Я (ОААТТС) и используя а/метил- Н/ТТР в смеси с аналогичны ед, активности иммобилизованной мн немеченными деэоксинуклеозид" дНТФ-азы (200 мг) . Суммарная оптичес-. трифосфатами с конечной молярной аккая плотность реакционной смеси дотивностью 1-4 кКи/моль.синтеза 96 о.е. (9252 нм), после 20 Данные по изменению параметров оработки - 62 о.е. (% 252 нм) . Пос- :способа представлены в таблице., Концентрация иммобилизованного фер- мента Уменьшение кои"центрацин фермента (меньшее40+1 мг/мл) Уменьшение выхода продукта . на 25 Х и более. Непроизводительное увеличениерасхода фермента в 1, 5-2 раза. Увеличение концентрации фермента (большее 40+1 мг/мл) Буфер Замена Оа-какодилата на Х-какодилат Уменьшение выхода продуктапо использованию трифосфатав 2 раза Уменьшение выхода продуктав 1,5 и болеераза рН реакционной рН7,0смеси рН) 7,5 Уменьшение стабильности фермента, в результате чего уменьшается число циклов его использования.ФПродолжение таблицы 1266165Ионы двухва"лентнмх металлов Замена Ия наСо при синтезена основе пуринов Составитель ВГоловаТехред И.Яндык корректор С. Юекмарю аййье т 4 шв ю Вф ЕТираж 348 ПодписноеВНИИПК Государственного комитета СССРво делам изобретений и открытий113035 в Иосква, И, Раущская наб., д. И 5 Редактор Г. БельскаяПроизводственно-нолигра 4 аческое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Замена Со на Ик. при синтезе на основе пиримидинов Уменьщение выхода целевогопродукта в 3раза при синтезеполи (ат) и в 4раза при синтезеполи ЧС) Уменьаейие выхода целевогопродукта в 1 7раза