Способ определения -глутамилтранспептидазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХшмнкмьюиРЕСПУБЛИК ОЕ Ш) 33/50 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 98,6 Х (ВЕ)Грубер,угустер 1971,-ГЛУТА 1 1 ИПя аналнти и способа ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Берингер Ианнхайм Гмб(56) С 11 п. С 1 ца. Аса, 3175-179.54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯРАНСПЕПТИДАЗЫ57) Изобретение касаетсческой химии, в частност определения Т -глутамилтранспептидазы (ГТП), используемой для диагностики заболеваний печени. Для интенсификации процесса используют другое более растворимое замещенное-глутамил- и -анилида --глутамил-сульфо (или карбокси)-и -анилид (ГА). Определение ГТП ведут обработкой ГАглицинолицином прн добавлении человеческой сыворотки. Далее определяютизменение оптической плотности (ОП)и скорость образования гииролизованного продукта. По разности ОП в минуту,берут средние значения и рассчитываютпоказатель энзимной активности. Снижается в два раза продолжительность определения, максимальная концентрация ГАсоставляет 6-8 ммоль против 2,9.а Е (мИмл) 3Изобретение относится к усовершествованному способу определенияУ-глутамилтранспептидазы, котораяиспользуется в клинико-химических лабораториях для диагностики заболеваний печени,ЬЦель изобретения - интенсификацияпроцесса.Поставленная цель достигаетсяза счет использования в качестве субстрата Т-глутамил-,3-сульфо-(иликарбокси) и -анилида.П р и м е р 1. Получение Т -глутамил-а-нитроанилид-карбоновойкислоты (СЫ РА-карбоновой кислоты).159,1 г 2-нитро"5-аминобензойнойкислоты (50 мг-моль) и 14,2 ангидрида Фталоилглутаминовой кислоты(55 мг-моль) растворяют в 50 мл абсолютного диоксана с добавлением 2013 мл трибутиламина, Реакционнуюсмесь кипятят в течение 2 ч при обратном потоке. После охлаждения вреакционную смесь добавляют 100 мл 2 н.аммиака и извлекают вэбалтыванием выделившийся трибутиламин с эфиром.Водный раствор концентрируют досуха,растворяют в метиловом спирте и спомощыа 80%-ного гидраэингидратаустанавливают рН 10. РеакционныйЗОраствор выдерживают около 20 ч прикомнатной температуре. При этомчастично выделяется продукт, которыйзатем Фильтруют и промывают метиловымспиртом, Метанольный Фильтрат кон 35центрируют досуха и растворяют остаточное масло приблизительно в 300 млдистиллированной воды.Этот водный раствор хроматорграФируют над колонкой с 100 мл Довекс4 О(Помех) Формиатной Формой, промываютЗОО мп дистиллированной воды, градуируя 2 л воды 0,5 н,раствора карбоната аммония. Элюат собирают 100 млФракциями и исследуют методом тонкослойной хроматографии в системе бутанол: ледяная уксусная кислота: водав соотношении 50:15:15 (проявлениехроматограмм, "в ультрафиолетовом свете синие пятна или после увлажнениянингидрином и последующего нагрева 5 Окоричневые пятна зон,содержащих ами-нокислоту).Фракции, содержащие продуктглутаминовая кислота --нитроанилид"-3-карбоновая кислота (значение КО, 25), собира,ат и концентрируют в вакууме досуха. Оставшийся порошок перемешивают з абсолютном спирте, фильтруюти сушат в вакууме над хлористым кальцием. ЭВыход 7 г т -глутамил- -нитро.анилнд-карбоновой кислоты, моноаммониевая соль (58% теоретического) .Ультрафиолетовый спектр:= 317 нм, Е = 11,7 см/моль/при 317 нм,П р и м е р 2. Применение г -глутамил- -нитроанилид-карбоновойкислоты (С 1 Л РА-карбоновой кислоты)для определения -глутамилтранспептидазы ( 7 - СТ) .При энзиматическом расщеплениивысвобождается 2-нитро-амннобензойная кислота.Проведение измерения,В кювету вводят пипеткой 1 М трис-буФер, 100 мг-моль глицилглицина,рН 8,25-2,8 мл 130 мг-моль ЯЛ РА"3-карбоновой кислоты в указанномбуфере 0,2 мл, нагревают до 25 С,определение начинают при добавлениичеловеческой сыворотки 0,2 мл, смешивают, оптическую плотность отсчитывают при 405 нм, одновременно включают хронометр. Через 1,2 и 3 мин отсчет повторяют.По разности оптических плотностейв минуту (а 1 /мин) берут средние значения и вводят его в.расчет,Расчет ведут следующим образом,Международная единица 0 являетсяэнзимной активностью, которая при25 С переводит 1 ммоль субстрата вшинуту. Это будет отнесено к 1 млжидкости тела, например, сыворотки,Для расчета энзимной активности намл (А) используют общую Формулу КоэФФициент экстинкции И)3-карбокси"4-иитроаиилина составляет в условиях опыта при 405 нм 9,4 см/ /ьщоль, Толщина И) слоя кюветы 1 см, объем используемой сыворотки (Ч) 0,2 мл, сумма объемов (ч) 3,2 мл.Измерение затухания Е осуществляется через промежутки в 1 мин. При этом МА ф 6 Е(405 нм)/мин х 1702 (мИмл).П р и м е р 3, Получение ф-глутамил-нитроанилид-сульфоновой кислоты.115 г анилин-,4"нитро"сульфоновой кислоты и 150 г ангидрида фталоилглу таминовой кислоты суспендируют в 2 л абсолютного диметилформамида и затем ф нагревают на масляной бане до 145 С. При достижении этой температуры сус 3 1253пензию выдерживают в течение 1 ч при145 С и затем охлаждают. Осадок от-,Фильпрозывают и концентрируют фильтрат досуха. Маслянистый остаток растворяют в метаноле и устанавливаютрН 9 807-ной гидроокисью гидразина,Через 24 ч отсасывают образовавшиеся кристаллы и промывают небольшимколичеством метилового спирта. Фильтрат сушат и при охлаждении осторожно 1 Оразлагают охлажденным ацетоном. Образующийся при этом осадок отсасывают,промывают хорошо ацетоном и растворяют остаток в воде при перемешивании. Нерастворимый в воде остаток 15отфильтровывают и с помощью аммиакаустанавливают рН раствора 7,5. Путемдобавления ацетона выкристаллизовывается аммониевая соль-глутамил-нитроанилид-сульфоновой кислоты.20Продукт очень хорошо кристаллизуетсяв светло-желтые кристаллики. Т.пл.186-187 С,Максимум поглощения спектра при290 нм Е = 4,57 см /ммоль. 25Выход около 115-120 г, причем15-20 г можно еще получить из кристаллизационного маточного раствора.Общий выход около 135 г соответствует 707 теоретического.ЗбРастворимость соединения при комнатной температуре хорошая и достигает около 1607 степени превращения-глутамил-д-нитроаяилида при одинаковых условиях.П р и м е р 4. Применение ЯЯРА-сульфоновой кислоты для опре"деления -СТ.При энзиматическом расщеплениисоединения по предлагаемому способувысвобождается-нитроанилид-сульФоновая кислота. 439 4Международная единица 11 являетсяэнзимной активностью, которая при25 С превращается 1 ммоль субстратав минуту, Это будет отнесено к 1 млжидкости тела, например сыворотки.Для расчета энзимных активностей намл (А) используют общую ФормулуЧ 000А=- ----- дЕ (мУ /мл)мин а ЧКоэффициент зкстинкции (е )-нитроанилид-сульфоновой кислоты в условиях опыта при 405 нм составляет 545, см /моль. Толщина Й) слоя кюветы 1 см, объем введенной сыворотки (Ч) 0,2 мл, сумма объемов (ч) 3,2. Измерение оптической плотности Я осуществляют через промежутки в 1 мин.Отсюда получаютА =ьЕ(405 нм) /мин х 2936 (мб/мл).Предлагаемый способ определения -глутамилтранспептидазы, предусматривающий использование в качестве субстрата т -глутамин-сульфо(или ,карбокси)анилид по сравнению с известным, где в качестве субстрата используют -глутамил-ь-нитроанилид, позволяет значительно интенсифицировать процесс. Максимальная скорость реакции достигается при концентрации лишь в интервале 6-8 ммоль, что осуществимо лишь с субстратом согласно изобретению благодаря его хорошей растворимости, Максимально достигаемая концентрация при использовании известного субстрата составляет 2,9 ммоль, в связи с очень ограниченной его растворимостью.Проведение измерения,Пипеткой вводят в кювету 0,1 трис-буФер, 150 мг-моль шлицилглицина, 45 рН 8,5 - 2,8 мл 130 мг-моль ОЫ РА- -3-сульфоновой кислоты в вьппеприве, денном буфере 0,2 мл, нагревают до 25 С, определение начинают добавкой человеческой сыворотки 0,24 мл, пере-Я мешивают, оптическая плотность отсчи-. тывается при 405 мн, одновременно включают хронометр. Точно через 1, 2 и 3 мин повторяют отсчетаПо разностям оптических нлотнос тей в 1 иик (ьЕмин) находят среднее значение и ввсдят его в расчеты.Расчет ведут следующим образом. В соответствии с изобретениемпри использовании карбоксильногонроиэводного достигают увеличениескорости реакции на 20, а в случаепроизводного сульфокислоты в двараза больше скорость; Это значит,что продолжительность определенияможет быть уменьшена вдвое.Формула изобретенияСпособ определения-глутамилтранспептицаэы путем обработки за- МЕЩЕННОГО 1 -ГЛУтамил-н-анилида глицилглицином при добавлении челове" ческой сыворотки и измерения скорости образования гидролизованного продук"12534 1 Составитель Л. ИофффеТехред В,Кадар Корректор С, ЧерниРедактор О. Головач Заказ 4634/60 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5та, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью интенсификации процесса,в качестве замещенного -глутамил --анилида используют 1 в глута -мил- сульфо ( или карбокси ) - ь -ани.лид,Ь11 риоритг т по признакам: 05,12,7; исходный продукт