Способ определения сиаловых кислот в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) (И) 4 С 01 И 33 ТЕНИЯ н с Ф 44ударственныиМолдавский ме- ауч и й рди Опря, М.И,Попо ИАПО ВЬИАЛЕ КИС-. или ацетилти тическую плот ей:органическ ктрофотометре кислоты рассч му графику.зм с х целеи в ель изобре СУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕР(57) Изобретение относится к бмии, предназначено длябиохимических процессовчеловека и животных и дческих и прогностическиклинической практике. Ц ия - повышение чувствительности спооба. Исследуемый материал гидролизу-, ют в 0,05 М растворе серной кислотыопри 80 С 1 ч. При этом происходит освобождение сиаловых кислот, входящих в состав гликопротеидов и гликолипидов исследуемой пробы. После охлаждения гидролизат подвергают периодатно" му окислению, добавляя раствор 0,025 М йодной кислоты на 0,125 М НС 1 до конечной концентрации 5 ммоль/л. Избыток йодной кислоты, мешающий дальнейшему определению сиаловой кислоты,разрушают тиомочевино мочевиной. Измеряют о ность окрашенной верх фазы при 550 нм на сп Концентрацию сиаловой тывают по калибровочн 1 фиг, 13559Изобретение относится к областибиохимии, а именно к анализу биологических объектов, и может быть использовано при исследовании биохимических5процессов в организме человека и животных, а также в клинической практике для диагностических и прогностических целей,Цель изобретения - повышение чув 10ствительности способа.На чертеже представлен калибровочный график,Способ осуществляют следующим образом. 15Исследуемый материал подвергаютгидролизу в 0,05 М растворе" сернойокислоты при 80 С в течение 60 мин.При этом происходит освобождение сиаловых кислот входящих в состав гли 20копротеидов и гликолипидов исследуемой пробы,После охлаждения до комнатной температуры гидролизат подвергают периодатному окислению. Для этого копределенному объему гидролизата, содержащего 3 - 25 нмоль сиаловой кислоты,добавляют свежеприготовленный раствор 0.,025 М йодной кислоты в 0,125 МНС 1 до конечной концентрации 5 ммоль/л;30пробу перемешивают и выдерживают30 мин при 37 С.Избыток йодной кислоты мешающийдальнейшему определению сиаловой кислоты, разрушают тиомочевиной илиацетилтиомочевиной, которые добавляют к исследуемой пробе в концентрации44-88 и 38-75 ммоль/л соответственно,Пробу перемешивают, после чего вносят 39-50 мкмоль/л 2 тиобарбитуровой40кислоты (рН 9,0), опять перемешиваюти помещают в кипящую водяную баню на7-10 мин. Затем пробу охлаждают 1 -2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают в термостате прио37 С, после чего окраску экстрагируютбутанолом, содержащим 0,69-1,03 моль/ло-фосфорной кислоты, Экстракцию осуществляют энергичным встряхиваниемпробы с последующим центрифугированием при 2000-3000 об/мин в течение503-5 мин. Окрашенную верхнюю органическую фазу отделяют и измеряют ее оптическую плотность при 550 нм на спектрофотометре. Контропем в данном случае является 0,05 М раствор серной кислоты. обработанный подобным образом. 33 ьКонцентрацию сиаловой кислоты рассчитывают по калибровочному графику.Способ поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Количественное определение сиаловой кислоты в сыворотке крови с использованием тиомочевины.В центрифужную пробирку вносят0,8 мл 0,05 М раствора серной кислоты и 0,005 мл исследуемой сыворотки,накрывают сверху стеклянной пробкойи пробирку помещают в термастат при80 С на 60 мин. По окончании гидролиза пробу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 0,2 мл 0,025 Мраствора йоцной кислоты в О, 125 МНС 1, перемешивают и выдерживают вотермостате 30 мин при 37 С. Затемприбавляют 0,2 мл 2,57.-ного водногораствора тиомочевины, пробу взбалтывают, вносят 1,0 мл дистиллированнойводы и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 Мраствором МаОН до рН 9,0. Пробу накрывают сверху стеклянной пробкой ипомещают в кипящую водяную баню на10 мин. После этого пробу охлаждают2 мин в водяной бане со льдом и столько же выдерживают ее в термостатеопри 37 С. Образовавшийся окрашенныйпродукт (хромоген) экстрагируют 2 млн-бутанола, содержащего 5 Т по объему85%-ной о-фосфорной кислоты. Экстракцию осуществляют путем энергичноговстряхивания пробы с последующим еецентрифугированием при 3000 об/минв течение 5 мин,Оптическую плотность окрашенной органической Фазы измеряют на спектрофотометре Сфпри 550 нм против холостой пробы, которая обрабатывается, как и опытная, но сыворотки не содержит. Окраска устойчива в течение нескольких часов.Поскольку объем органической фазыснедостаточен для наполнения стандартной кюветы (10 мм) спектрофотометра СФ, при измерениях оптической плотности необходимо испольэовать оптическую приставку для фотометрии малых объемов раствора.Концентрацию сиаловых кислот в исследуемой сыворотке рассчитывают по формулеХ = а 0,2 (1)55933 з 13где а - найденное по калибровочномуграфику количество сиаловойкислоты в исследуемой пробе;0,2 - коэффициент пересчета.Для построения калибровочного графика готовят ряд.разведений основногостандартного раствора, содержащего100 мг/л (323,3 ммоль/л) сиаловойкислоты, Каждое рабочее разведениеобрабатывают, как описано вышеХолостую пробу обрабатывают аналогиФо,но вместо рабочего разведения сиаловой кислоты используют 0,8 мл 0,05 Мраствора серной кислоты. После измерения оптической плотности растворовстроят калибровочный график (см. четтеж).Оптическая плотность (П) исследуемого образца сыворотки крови 0,300.По калибровочному графику находят количество сиаловых кислот (в данномслучае а=10,81 нмоль). Далее по формуле (1) вычисляют концентрацию сиаловых кислот в исследуемой сыворотке(2, 16 ммоль/л),П р и м е р 2Количественное определение сиаловых кислот в сывороткекрови с использованием ацетилтиомочевины.Предварительный гидролиз исследуемого образца сыворотки крови и периодатное окисление пробы проводят аналогично примеру 1Далее в пробувносят 0,8 мл 1,5 -ного раствораацетилтиомочевины, взбалтывают, добавляют 0,4 мл дистиллированной водыи 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 М раствором ИаОН до рН 9,0, накрывают сверхустеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, Затемпробу охлаждают 2 мин в водяной банесо льдом и столько же. выдерживают вотермостате при 37 С, добавляют 2 млн-бутанола, содержащего 5 по объему85%-ной о-фосфорной кислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 минпри 3000 об/мин.Оптическую плотность окрашеннойорганической Фазы измеряют на спектрофотометре СФпРи 550 нм противхолостой пробы, которая обрабатывается, как и опытная, но сыворотки несодержит. Окраска устойчива в течениенескольких часов.Оптическая плотность исследуемогообразца сыворотки крови Д=0,540. Покалибровочному графику находят количество сиаловых кислот (в данном случае а=17,93 нмоль). Далее по формуле (1) вычисляют концентрацию сиаловой кислоты в исследуемой сыворотке(3,59 ммоль/л).П р и м е р 3. Количественное определение сиаловых кислот в эритроцитах с использованием тиомочевины.10 Гепаринизированную кровь центрифугируют при 3000 об/мин 7 мин, плазмуи верхний слой осадка форменных элементов, содержащий преимущественнолейкоциты, удаляют. Затем осадок 15 эритроцитов трижды промывают 0,9 -нымраствором хлористого натрия путемцентрифугирования при описанном режиме.В центрифужную пробирку берут 20 0,1 мл эритроцитарной массы, добавляют 0,7 мл 0,9 -ного раствора МаС 1и 1 мл О, 1 М раствора соляной кислоты, тщательно перемешивают, накрывают сверху стеклянной пробкой и проо 25 бирку помещают в термостат при 80 Сна 60 мин, По окончании гидролиза опробу охлаждают до комнатной температуры, после чего добавляют 0,1 мл30 .-ного раствора К 4 Ге(СИ) ЗН 0 и З 0 0,1 мл 40 -ного раствора уксуснокислого цинка, тщательно перемешиваюти центрифугируют при 3000 об/мин втечение 7 мин. В другую чистую пробирку отбирают 0,8 мл прозрачной надосадочной жидкости, добавляют 0,2 мл0,025 М раствора периодата натрия в0 5 М растворе серной кислоты и выодерживают 30 мин при 37 С.Затем прибавляют 0,2 мл 2,5 -ногораствора тиомочевины, пробу взбалтывают, вносят 1,0 мл дистиллированнойводы и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 Мраствором ИаОН до рН 9,0. Пробу накрывают сверху стеклянной пробкой ипомещают в кипящую водяную баню на10 мин. Затем пробу охлаждают 2 минв водяной бане со льдом и столько жеовыдерживают в термостате при 37 С, 50добавляют 2 мл н-бутанола, содержащего 5 по объему 85 -ной о-Фосфорнойкислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин,Оптическую плотность окрашеннойорганической фазы измеряют на спект,рофотометре СФпри 550 нм противхолостой пробы, которая обрабатывается, как и опытная, но эритроцитов не . содержит (вместо эритроцитарной массы55933 ВПо калибровочному графику находятколичество сиаловой кислоты (в данномслучае а=10,46 нмоль). Далее по фор 5муле (2) вычисляют концентрацию сиаловых кислот в исследуемом образце,эритроцитов (261,5 мкмбль/л).Предлагаемый способ достаточноспецифичен, воспроизводим, дает пра 10 вильные результаты, обладает большейчувствительностью по сравнению с известным способом. Использование тиомочевины и ацетилтиомочевины повышаетчувствительность предлагаемого способа на 20 и 26 соответственно,Это позволяет более тонко улавливать изменения концентрации сиаловойкислоты в организме при различных патологических состояниях,Кроме того, предлагаемый способпо сравнению с известным являетсяменее токсичным, поскольку исключаетиспользование сильноядовитого арсенита натрия, а также высоколетучей,25 агрессивной смеси бутанола с солянойкислотой. Б 13 берут О, 1 мл 0,9 .-ного раствора ЯаС 1). Концентрацию сиаловой кислоты в эритроцитах рассчитывают по формулеХ = а 25, (2) где а - найденное по калибровочномуграфику количество сиаловойкислоты в исследуемой пробе;25 - коэффициент пересчета.Оптическая плотность исследуемого образца эритроцитов донора Д=0,370. По калибровочному графику находят ко" личество сиаловой кислоты (в данном случае а=13,32 нмоль). Далее по формуле (2) вычисляют концентрацию сиаловых кислот в исследуемом образце эритроцитов, (333,0 мкмоль/л).П р и м е р 4, Количественное определение сиаловой кислоты в эритроцитах с использованием ацетилтиомочевины.Получение эритроцитарной массы, гидролиз и периодатное окисление пробы проводят аналогично примеру 3.Далее избыток периодата разрушают добавлением 0,8 мл 1,5%-ного раствора ацетилтиомочевины, пробу взбалтывают, вносят 0,4 мл дистиллированной воды и 0,6 мл 0,2 М раствора тиобарбитуровой кислоты, доведенного 1 М раствором НаОН до рН 9,0, накрывают сверху стеклянной пробкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробу охлаждают 2 мин в водяной бане со льдом и столько жевыдерживают в термостате при 37 С, добавляют 2 мл н-бутанола, содержащего 5 Е по объему 85 .-ной о-фосфорной кислоты, энергично встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.Оптическую плотность окрашенной органической фазы измеряют на спектрофотометре СФпри 550. нм против холостой пробы, которая обрабатываетея, как и опытная, но эритроцитов не содержит (вместо эритроцитарной массы берут О, 1 мл О, 9%-ного раствора ИаС 1) . Оптическая плотность исследуемого обРазца зритроцитов донора Д=0,315,Формула изобретения ЗО Способ определения сиаловых кислотв биологическом материале путем егогидролиза серной кислотой, обработкииодной кислотой, разрушения избыткаиодной кислоты, добавления тиобарби- ЗБтуровой кислоты с последующей экстракцией окрашенного продукта бутанолом и спектрофотометрирования, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения чувствительности способа, разрушение избытка иодной кислоты осуществляют добавлением тиомочевины в конечной концентрации 4488 ммоль/л или ацетилтиомочевины вконечной концентрации 88-75 ммоль/л,тиобарбитуровую кислоту берут в концентрации 39-50 мкмоль/л, а в бутанолдополнительно вводят о-фосфорнуюкислоту в конечной концентрации 0,691903 моль/лю/5 полиграфическое предприятие,вен оиз Тираж ИИПИ Государств по делам изобрет 13035, Москва, Ж