Способ выделения лизоцима

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦЕЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 8012 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ИИ К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54)(57 из яичн присутс ла, о т-13 Бюл. В 2 лью про дой пририда щелсреде 0нагрева95 Сипбалласт(56) Патент Фкл. А 61 К 19АвторскоеВ 247703, кл. НИЕ ИЗОБРЕТЕН ордена Трудовогои сельскохозяйственная льсоне, П и Р.А. Ла 8.8) анции В 2 00, 1972видетельс А 23 7 1/ СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИИА го белка путем экстракции в вии хлорида щелочного металл и ч а ю щ и й с я тем, что, упрощения и ускорения процесодят экстракцию лиэоцима во- рН 3,0-4,0 и содержании хлоочного металла в реакционной 5-4,0 мас.7 с одновременным ием реакционной среды до 80- оследующим отделением осадка ых белков.1 12391Изобретение относится к способам получения фермента лизоцима, широко применяемого в разных областях народного хозяйства, в том числе в медицине, пищевой промышленности, биологии.Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса выделения лиэоцима.Лизбцим из яичного белка экстра гируют подкисленной водой с одновременной денатурацией белков яйца при повышенных температурах.Лизоцим является сильноосновным белком мол. массы 14-93 тыс, (в эави симости от сырья) и в воде образует тельВ яичном белке при наличии среды, близкой к нейтральной, (рН 6-7) лизоцим с альбумином образует комплекс, 2 О улучшающий устойчивость фермента, но препятствующий выделению лизоцима. Понижение рН добавлением органических или неорганических кислот раэ" рушает комплекс с образованием соот ветствующих солей лиэоцима с органическими или неорганическими кислотами, которые лучше экстрагируются водой.Д я активации лизоцима, разрУшения ЗО устойчивых суспензий .и улучшения экстРакции, к раствору, добавляется соль щелочного металла (хлоридш). 473Отделение посторонних белков отлизоцима осуществляется повышениемтемпературы до 80-95 С таким образом,чтобы коагулировалась основная массапосторонних белков. Таблица 1 Температу Раствор после добавления яично- оС го белка Среднийвыход,Е Гелевидная масса, очень слабо 18фильтруется 60+ 5 Гелевидная масса с последующим 28выпадением хлопьев 70+5 80 + 5 Осаждение нитевидной массы пос тороннего белка 69 90 1 595 1 101 То же 48 55 ро, что может вызвать потери фермента лизоцима. П р и и е р 2. Процесс проводят,как в примере 1. Отбирают 10 мл яич Оптимальная температура для выделения лизоцима 80-95 дС.Ниже 60 С денатурация посторонних белков происходит недостаточно быстП р и м е р 1, 10 л свежего яичного белка без предварительного отделения овомуцина гомогенизируют перемешиванием и разделяют на 10 частей. В колбу вместимостью 3 л заливают 1 л воды,добавляют уксусную кислоту до достижения рН 3,5; включают мешалку, обогрев и растворяют 20 г хлористого натрия. Устанавливают температуру, фС:1 и 2 опыты 603 и А опыты 705 и 6 опыты 807 и 8 опыть 1 909 и 10 опыты около 100 В горячий раствор при перемешивании добавляют 0,5 л яичного белка в течение 1-1,5 мин. Полученную суспензию фильтруют и осадок промывают 0,5 л подкисленной воды, содержащей соль щелочного метапла, фильтраты соединяют и охлаждают.1 Выход лиэоцима в зависимости от температуры кислого солевого раствора приведен в табл, 1.з 1239147 ного белка и вливают в 30 мл раство- . ра, содержащего 2% хлористого натрия и уксусную кислоту различной концент рации,Температура в рабочем растворе 85 + 10 С.Ферментная активность фильтратов после выделения лизоцима из яичного белка в зависимости от концентрации уксусной кислоты представлена в 0 табл. 2. 4ПРодолжение табл 23 4,3 0,755 800 4,25 1400 3,0 5,0 4,15 17703,9 1640 1520 Таблица 2 6,0 3,85 КоцентрацияСН СООН е % Ферментная активность фильтратов, ед/мл лизо- цима РН послеокончанияоперации 3 5,95 0,250,5 500 4,63 Концентрациякислоты, % Ферментная активность, ед/мл лизоцима РНраст Серная Фосфорная кислота Лимонная кислотакислота Г вора Соляная кислота0,4 Н,ро,Лимонная.0;5 5 Не определена Не определена Нет Нет 0,005 0,075 НС 1 НС 1 0,01 Не определена Нет 0,15 4Нет Не определена н, 804 Н РО 2350 2500 Лимонная 2НС 1 . 0115 210-215 2550 23000,3Н,РО,Лимонная 5,0 7,0 3,7 1460153165 1370 Оптимальная концентрация уксуснойкислоты, необходимая для начала образования солей лизоцима, составляетОф 5-5 е 0%,И р и м е р 3. Опыт проводят,как в примерах 1 и 2.Ферментная активность фильтратов. в зависимости от концентрации разныхкислот дана в табл. 3.Таблица 31239147 К раствору добавляют различные количества хлористого натрия, калия илития для установления оптимальнойконцентрации солей при количествеяичного белка 10 на 25 мл раствора.Ферментная активность фильтратовпосле выделения лизоцима из яичногобелка в зависимости от концентрации 10 солей указана в табл. 4.Таблица 4 Для определения лизоцима необходимо определенное количество любой кислоты, достаточное для образования солей лизоцима, независимо от водорддйого показателя отдельной кислоты. П р и м е р 4. Опыт проводят, какв примерах 1 и 2. Концентрация соли, 7 Ферментная активность, ед/мл лизоцима Концентрация уксусной кислотыИаС 1 КС 1 1,хС 1 Е рН 100 Нет Нет 1900 1900 1850 1850 1700 2000 1700 1600 1600 4,2 4,18 1900 3,0 2200 3,0 4,2 1850 3,0 4,1 3,0 500 4,1 0 3,0 4,1 Оптимальная концентрация солей 0,5-4,0 Х, При 57-ной концентрации солей наблюдается снижение выхода лизоцима.П р и м е р 5. Опыт проводят, как в примерах 1 и 2. 10 мл яичного белка добавляют к раствору, содержащему уксусную кислоту, и к чистой воде при 85 + 10 оС Активность лизоцима при экстракции водой, ед/мл лизоцима, в среднем составляет О,Активность лизоцима при экстракции раствором уксусной кислоты без добавления хлористого натрия при рН 3,9 ч среднем составляет 1270 ед/мл лизоцима.Предлагаемый способ получения лизоцима дает возможность по сравнению ВНИИПИ Заказ 3354/2 1 Тираж 490 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород ул. Проектная, 4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 2,0 2,0 2,0 3,0 3,0 3,0 5,0 5,0 5,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 с известным резко увеличить производительность установки и организоватьпромышленное получение фермента дляразличных отраслей народного хозяйства, в том числе для сельского хозяйства и пищевой промышленности, ускоритьпроцесс выделения до 16 ч; испольэовать отходы, получаемые при осуществлении предлагаемого способа, в пищевой промьппленности, например, всырорелии, так как они представляютсобой белок, содержащий около 10-307остаточного лизоцима; сократить расход рабочего времени, что на полупромьппленных и лабораторных установках составит около 140 человеко-ча"сов на каждый кг лиэоцима; сэкономитьэнергоресурсы, так как процесс нетребует громоздких холодильных блоков.