Способ определения активности клеточного иммунитета

.иМ Его клеточицина,АКТИВНО ем выяв ПРЕДЕЛЕ УНИТЕТА(54) (57) СПОСО ТИ КЛЕТОЧНОГО ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Иркутский госудцинский институт(56) Методы изученияного иммунитета, - М1974, с. 125-133. ления цитотоксического действия сенсибилизированных лимйоцитов на клетки-мишени, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точностии ускорения способа, в качестве клеток-мишеней используют гранулоцитыпосле их контакта с убитыми бактериальными клетками, а цитотоксическоедействие лимйоцитов выявляют по наличию миелопероксидазы и при увеличении или снижении ее содержания относительно нормы определяют повышениеили снижение активности клеточного ммунитета соответственно1 118 С ЛИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния клеточного иммунитета у больных с различными инфекционными заболеваниями вЦель изобретения - повышение точности и ускорение способа.Способ осуществляют следующим образом. 10Производят забор крови у больного в количестве 15-20 мл на гепарине (20 ЕД в 1 мл), Из полученной крови выделяют лимфоциты путем Фракционирования на одном из общеупотребляе мых градиентов плотности. Лимфоциты трижды отмывают в растворе Хэнкса с 207. гидролиэата лактальбумина (центрифугирование при 100 я в течение 5-10 мин) и суспендируют в среде р 0 культивирования в концентрации 0 5-1 0 в 1 мл, Полученную взвесьтФо до использования хранят при 0-4 С.Для получения клеток-,мишеней производят забор крови у здорового человека 0 1 группы в количестве 15-20 мл на цинтроглюкофосфате. К половине объема этой крови добавляют взвесь бактерий - возбудителей заболеваний, убитых прогреванием при температуре, губительно действующей на данные микроорганизмы. К остальной части крови добавляют взвесь убитых таким же образом сапройитных бактерий, которые используются в качестве контрольных антигенов. При выборе конт 35 рольных антигенов руководствуются отсутствием сенсибилиэации организма человека к этим бактериям и принадлежностью их к тому же семейству,40 что и возбудитель заболеванияВзвесь убитых бактерий добавляют к крови в8 конечной концентрации 0,5 -1 10 в 1 млду Инкубацию проб производят в пенициллиновых Флаконах при 37 оС в газо-вой среде, состоящей из 57 углекислого газа и 953 атмосферного воздуха. Все манипуляции проводят с соблюдением стерильности. Через 4-5 ч производят центрифугирование проб при 100 я в течение 10-15 мин и в надосадочной жидкости определяют пероксидазную активность. Для этого готовится 0,17.-ный раствор солянокислого бензидина в ацетатном буфере (рН 4,6) и ЗЕ-ный раствор перекиси водорода в дистиллированной воде. К 2 мл раст:вора бензидина добавляют 0,1 мл раствора НО и О, 1 мл надосадочной жидкости культур. Через 2-3 мин раэвиКровь с бактериями инкубируют в течение 20-30 мин при 37 С. Послео этого для остановки Фагоцитоза добавляют колхицин до конечной концентрации 20-25 мкг в 1 мл и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение того же времени, Затем иэ крови с возбудителями заболевания и с бактериями - контрольными антигенами выделяют гранулоциты. Для этого, осаждают эритроциты добавлением желатина до конечной концентрациио 0,8-17 и инкубацией при 37 С в течение 20 мин, а полученную плазму 01 2с лейкоцитами Фракционируют на том же градиенте плотности, который используется для выделения лимфоцитов. Выделенные гранулоциты обрабатывают 0,84 -ным раствором хлорида аммония для разрушения оставшихся эритроцитов, трижды отмывают в растворе Хэнкса с 207. гидролизата лактальбумина и суспендируют в среде культивирования в конечной концентрации 0,5-1 10 в 1 мл.бКультивирование клеток производят в среде 199, содержащей 207 гидролизата лактальбумина, 107. инактивированной нормальной человеческой сыворотки АВ 1 У группы крови без следов гемолиза, пенициллин 100 ЕД и стрептомицин 100 мкг в 1 мл.К 1 мл взвеси лимфоцитов больного добавляют 1 мл взвеси гранулоцитов здорового человека, незавершен- но профагоцитировавших бактерий возбудители заболевания. В качестве контроля к 1 мл взвеси тех же лимфоцитов добавляют 1 мл взвеси тех же гранулоцитов, незавершенно профагоцитировавших бактерий - контрольные антигены, Помимо опытных и контрольных проб производят культивирование отдельно взятых гранулоцитов, профагоцитировавших возбудителей заболевания или контрольные антигены с добавлением равных объемов среды культивирования для определения степени спонтанного лизиса клеток-мишеней. Для оценки полного лизиса клеток- мишеней гранулоциты, профагоцитировавшие опытные или контрольные антигены, помещают в соответствующих концентрациях в дистиллированную во1180001 4способом, отражает степень сенсибилизации цитотоксических лимфоцитовантигенным комплексом возбудителейзаболевания и их способность разрушать клетки-мишени, содержащие возбудитель, т.е. по данному показателю оцениваются протективные свойства клеточного иммунитета по отношению к возбудителю и в целом - активность его при данном заболевании.П р и м е р 1. Определение активности клеточного иммунитета по цитотоксическому действию лимфоцитов производят у здоровых людей по отношению к патогенному стафилококку (Штамм Вууд).В качестве контрольного антигенаиспользуют сапрофитного представителя того же семейства Мсгососсоз1 узойесдсцз (штамм 2665) . Взвесьстафилококков и микрококков прогреовают при 60 С в течение 30-35 мини добавляют к крови в конечной концентрации 110 вается голубая окраска, интенсивность которой оценивают фотоэлектроколоримеурически или спектрофотометрически.На основании полученных данных вычисляют количество клеток-мишеней, разрушенных в опытных и контрольных пробах, с учетом спонтанного лизиса и по отношению к показателям полного лизиса мишеней (Л) по формуле 10 Е- Е----- 1007Еоз где Е - показатель пероксидазнойактивности в пробах с опытными или контрольными клет- ками-мишенями и лимфоцитами больного;Е - показатель пероксидаэной2активности в пробах с изо- щлированными опытными иликонтрольными клеткамимишенями;Е - показатель цитотоксической3активности в пробах с полным разрушением опытныхили контрольных клетокмишеней.Цитотоксическую активность лимфоцитов больного по отношению к возбудителю заболевания оценивают по разнице между показателями лиэиса клеток-мишеней в опытных пробах и аналогичным показателем контрольных проб. Выполнение способа занимает не35 более 8-9 ч,Цитотоксическая активность лимфоцитов, определяемая предлагаемым Время инкубации,ч 16 Показатель цитотоксической активности, 7 12,4+3,5 23,12+2,1 21,4+2,5 22,2+2,3 19,3 +3,6 шения клеток-мишеней под действием цитотоксических лимфоцитов.П р и м е р 2. Определение цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к патогенному стафило кокку производят у больных с абсце;дирующию пневмониями стафилококковой Угиологии, подтвержденной бактериологически, Определение указан Как видно из таблицы, показатель цитотоксической активности достигает максимума через 4 ч инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями и в последующие сроки культивирования держится на том же уровне. Следовательно, в предлагаемом способе время инкубации 4-5 ч определяется оптимальным для максимального раэруЛимфоциты получают из крови здоровых людей - доноров крови, клетки- мишени получают также из крови здоровых людей 01 группы. Культивирование опытных и контрольных проб, а также отдельно взятых клеток-мишеней производят при 37 С в соответствуюощей газовой среде в течение 3,4,5,8 и 16 ч. Показатели цитотоксической активности лимфоцитов здоровых людей по отношению к патогенному стафилококку, определяемые в различные сроки культивирования, представлены в таблице.Заказ 5782/3 Тираж 721 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 ного показателя производят аналогично примеру 1,Больной К. Диагноз: правосторонняя верхнедолевая абсцедирующаяпневмония.В пробах с опытным антигеном:Е = О, 113, Е.г = 0036, Ез = 0,380Аап =.(О 113 0035):0380 100= 206%.В пробах с контрольным антигеном:Е, = 0,05, Е 2 = 0,032, Е = 0,360.Ак 005 0032) 036 100 51 Аоа Ак = 20 б 51= 14 5%Показатель цитотоксической активности лимфоцитов по отношению кстафилококку составляет 145%.Больной Н. Диагноз: правосторонняя верхнедолевая абсцедирующаяпневмония. Клиническое течение характеризуется быстрой в течение 5 дн,нормччизацией температуры тела, пре.кращением отделения мокроты в тот жесрок, быстрым уменьшением воспалительной инфильтрации и уменьшениемразмеров полости, выявляемых рентгенологически.В пробах с опытным антигеном:Е 1 = 0,223, Е г = 0,048, Ез = 0,410.Аоп= (0,223-0,048): 0,41100%= 40,3%. Показатель цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку у больного увеличен до, 40,3%,Приведенные примеры свидетельствуют о том, что у больного с неблагоприятным течением заболевания наблюдается снижение цитотоксической ак 10 тивности лимфоцитов по сравнению создоровыми людьми и интенсивностьэтого снижения отражает степень тяжести заболевания. Благоприятное. течение заболевания сопровождается15 повышением цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку.Проведение параллельных определений цитотоксической активности лим 20 фоцитов здоровых людей и больныххроническим тонзилитом предлагаемыми известным способами по отношениюк гемолитическому стрептококку илиего аллергену (растворимому антиге 25 ну) позволяет заключить что предложенный способ обладает более высокойточностью в сравнении с известным,В частности, с помощью предлагаемогоФспособа удается выявить более глубоЗО кие изменения цитотоксицеской активности лимфоцитов по отношению к гемолитическому стрептококку в 66,6+12,4 случаев, а степень повьппенияточности в сравнении с известнымсоставляет 3 1,6" 11,2 . Постановкареакции занимает всего 4-5 ч.