Способ определения супероксиддисмутазной активности в крови

(57) Изобретение относит может быть использовано активности супероксиддис Цель изобретения - пов тел ьности и точности изме фермента супероксиддис крови человека, Для этого тов получают экстракты, с Измеряют люцигенин-завминесценцию, отражающу образования супероксидн аутоокислении кверцетина ние этого свечения СОД-со трактами крови, По ка графику, построенному дл препаратов фермента, оп жание СОД в исследуемых 1 табл.(71) 2-й Московский гоцинский институт имучно-производстведетельство СССР1 й 33/16, 1987,В водно-спиртовая содержит супеГоксиддисмутазу (СОД): интерфаза в виде тонкой пленки темно-красного цвета включает гемоглобин и нижняя - прозрачная, хлороформная, СОД на содержит. Осторожно отбирают верхнюю часть супернатанта и переносят в отдельную пробирку, разводят в 50 раз 20 мМ фосфатном буфером (рН 7,8) и в дальнейшем используют для анализа.Отдельно приготавливают стандартные растворы коммерческой СОД (Вегпцпег) с исходными концентрациями 800, 400, 200, 100, 50, 25 и 12,5 нг/мл,1. Проведение ХЛ-анализа.В кювету для измерения ХЛ добавляют 700 мкл среды, содержащей 20 мМ фосфатный буфер(гчаНРО 4-КН 2 РО 4), 100 мкМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Ма), 40-60 мкм люцигенина (319 аа), рН 9,6. Регистрация ХЛ производилась на люминометре 1 КВ 1251 (Швеция) в непрерывном режиме при температуре 27 С и постоянном перемещении содержимого кюветы. В течение 2 мин ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРСИДДИСМУТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В КВИ Изобретение относится к разделу клинической биохимии и может быть использовано в отделениях больниц и НИИ при обследовании больных для направленного подбора химиотерапевтических средств и контроля эа эффективностью проводимого лечения.Цель изобретения - повышение чувствительности и точности, а также ускорение способа.П р и м е р 1, Приготовление образца крови.Из пальца пациента отбирают 0,1 мл крови и добавляют к 0,9 мл холодной дистиллированной воды. Через 10 мин после завершения гемолиза эритроцитов в пробирку приливают 2 мл холодной экстрагирующей смеси (1 мл эталона + 1 мл хлороформа). Содержимое пробирки интенсивно встряхивают 5 мин и центрифугируют 60 мин при 16000 д и температуре 0-4 С. После центрифугирования смеси в пробирке представляет собой 2 фазы: верхняя - прозрачная,ся к медицине и для определения мутазы в крови. ышение чувствирения активности мутазы (СОД) в из крови пациенодержащие СОД, исимую хемилюю интенсивность ых радикалов при , и ингибировадержащими экслибровочному я коммерческих ределяют содеробразцах крови,регистрируют фоновое свечение (Яо). С по- В таблице приведены результаты исслемощью микродозатора в кювету автомати- дования,чески вводятся 10 мкл раствора кверцетина А работах разных авторов активностьв концентрации 0,1 мг/мл, приготовленного СОД соотносят таким показателям крови: кна диметилсульфоксиде, В ответ на добавку 5 числу клеток, на г гемоглобина, на мл целькверцетина развивается интенсивное све- нойкровиилизритроцитов. Первыедваспочение, которое через 1 мин выходит на по- соба представления результатов по мнениюстоянный уровень, который сохраняется в большинСтва исследователей наиболее потечение 15 мин и более. Производится под- лно отражают изменения активности СОД всчет интегрального свечения за 2 мин (Яд). 10 крови, В то же время необходимо учитывать,Обычно величина Зд составляла 1800- что при некоторых заболеваниях (талласе 200 ййй мв. мии и дефиците железа в крови) значенияВ первой серии опытов через 2 мин по- активности при пересчете на г гемоглобинасле кверцетина в кювету микродозатором могут быть завышены. В таких случаях ак, добавляют по 20 мкл стандартных раство тивность СОД лучше выражать на число клеров СОД. На добавление СОД происходит ток, Учитывая эти обстоятельства, нашикое снижение интенсивности ХЛ. Под- результаты представлены в 2-х разных форсчитывают светосумму свечения за 2 мин мах. Средние значение активност Дпосле добавления фермента (ЯБ), При кон- крови здоровых доноров составилицентрации СОД в кювете 10 нг/мл ЯБ была 20 1797+313 мкг/г гемоглобина или 11,7 +равна 370 мв, что составляет 19,5 от вели- +4,0 нг/10 эритроцитов, По данным разчины ЯБ в отсутствии фермента. По реэуль- ных авторов активность СОД в рови равнататам опытов с СОД сроят калибровочный 836, либо 267 мкг/г гемоглобина.график зависимости 7 ь ингибирования ХЛ Таким образом, предлагается способ,от конечной концентрации фермента; 25 который позволяет определять содержаниеСОД в крови людей, обладает рядом преф, б = 100 х 100 имуществ по сравнению с известными ра 5ингибирования =5 А 8 Бнее:При соблюдении всех укаэанных усло- высокой чувствительностью (для одноговий 500 ингибирование ХЛ-реакции, со измерения требуется 20 мкл капиллярнойпровождающей аутоокисление кварцетина крови); наименьшая определяемая конценв щелочной среде, наблюдается при конеч- трация СОД составляет 0,5 нгlмл,ной концентрации СОД, равной 2 нг/мл, высокой специфичностью (регистрируПри спектрофотометрической оценке такой ются исключительно супероксидные радиже ингибирующей зффкт СОД наблюдается 35 калы, которые являются субстратом дляДля определения содержания СОД в хорошей воспроизводимостью резулькрови человек вовека вместо фермента в измери- татов(в параллельных пробах разброс покат 0,5-1тельную кювету люминометра автоматиче- зателей не превышает, -);ски добавляют 20 мкл супернатанта через 40 требуются малые затраты труда и вре 2 мин после кверцетина. Аналогичным обра- мени (один анализ занимаетмин);эом рассчитываютингибирования ХЛ и возможностью автоматизации при маспо калибровочному графику определяют со- совых обследованиях.держание СОД в исследуемых образцахк ови, 45 Формула изобретен и яР эультаты анализа.еэультаты анализа. Способ определения супероксиддисмуВ крови пациента в начале анализа из- таэной активности в крови путем отборамерялось количество эритроцитов и содер- крови, проведения гемолиэа эритроцитов,жание гемоглобина по общепринятым добавления гемолизата в среду инкубации,икам. П и расчете количества СОД в 50 содержащую кверцетин, измерения кинетиин после ю имк овиучитываетсяраэведениецельнойкро- ки окисления кверцетина с по ду щви на всех стадиях приготовления СОД-со- подсчетом % ингибирования этой реакции вдержащих супернатантов и в ходе сравнении с контролем, о тл и ч а ю щ и йс я тем, что. с целью повышения чувствиХЛ-анализа.55 тельности и точности, а также ускоренияПредлагаемый способом было иэмере- способа, гемолиэат предварительно обрано содержание СОД в крови 9 взрослых батываютсмесью хлороформ:зтанол при содоноров в возрасте отэрасте от 26 до 44 лет и 5 отношении гемолизат;смесь 1:2 пообьему,больных с гемолитическими анемиями, центрифугируют, отделяют водно-спиртоказ 336 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Произво но-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 вую фазу и добавляют ее в среду инкубации, которая дополнительно содержит люцигенин, измеряют кинетику окисления по хемилюминесценции с последующим расчетомингибирования свечения по калибровочной кривой.