Иммуносорбент для выделения лейкозно-измененных лимфоцитов из крови животных

Сото з СоветсиикСфциалистиииесииаРеспубликз ОЛ ИСАНИ ЕИЗОВРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 918855(5 )М. Кл. с присоединением заявки МС О 1 И 33/48 А 61 В 10/00 ВЬеударетюеВ комитет СССР да далам,кэобрвтекнЭ к еткрытий(088. 8) Дата опубликования описания 070 Щ 2 М.М.Маурицас, Г.В.Иикалаускене, Н.П.Дикин не, -В.Н.Тамошюнас, Г.В.Куделева, С.В.Чапенко" фи Й.И.НагаеваИнститут биохимии Ай Литовской ССР и Институтмикробиологии им. Кирхенштейна.;, 1(54) ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛЕЙКОЗНО-ИЗМЕНЕННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ИЗ 1 РОВИ ЖИВОТНЫХИзобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной иммунологии, и может быть использовано при препаративном выделении лейкемических лимфоцитов для морфологических, биохимических и иммунологических иссле дований. Известно выделение лимфоцитов из крови больныхлейкозом животных пу"тв тем центрифугирования в градиенте плотности фиколизопака по методу А.ВОуюп Е 12Однако этот метод является трудо". емким и требует сложного оборудования5Наиболее близким к изобретению яв" ляется иммуносорбент для разделения Т,В и О клеток, содержащий активиро" ванный ВгСМ"ом сефадекс С"200, покрытый анти-Р(аЬ) антителами, Соотношение осевшего неактивированного геля (мл) е анти-Г(аЬ) антителами (мг) 3:1 Г 2 3. Однако известный иммуносорбент не позволяет выделить отдельную популяцию лейкозных лимфоцитов.Целью изобретения является повышение селективности в отношении лейкозно-измененных клеток.Поставленная цель достигается тем, что в качестве белка используют -глобулиновую фракцию, содержащую антитела, выделенные из сыворотки лошадей, иммунизированных лимфоцитами крови больных лейкозом коров. А также тем, что соотношение осевшего неактивированного сефадекса 6-200 (в мл) с-глобулиновой фракцией (в мг) составляет 1:8 - 1:6.П р и м е р. Для получения лошадиной антилимфоцитарной сыворотки против лимфоцитов больных лейкозом коров АС-Л(ЛЛ) иммунизируют лошадей лимфоцитами, выделенными из крови больных лейкозов коров. Полученную сыворотку подвергают определенным адсорбциям.3 9885Для приготовлений иммуносорбентаберут бО мл осевшего сефадекса 6-200(сухого геля 2 г, размером частиц40 - 120 мкм), который активируютбромцианом (100 мг ВтО на 1 мл осев 5щего геля). Активированный сефадекс6-200 инкубируют 4 ч при комнатнойтемпературе с 480 мг у -глобулина,выделенного из лошадиной антилимфоцитарной сыворотки АС-Л(ЛЛ). Избытокбелка отмывают О, 1 М баротным буфером рН 8,5 Активные группы геляблокируют 1 М этаноламина рН 9 в течение 2 ч. Блокирующий агент отмывают 0.,1 М боратным буфером рН 8,5.Полученный конъюгат отмывают несколько раз поочередно 0,1 М боратным буфером рН 8,5 с 0,5 М ИаС 1 и 0,1 Мацетатным буфером рН 4,0 с 0,5 МИаС 1.Колонки размером 1,5 х 10 смзаполняют иммуносорбентом, предварительно отмытым 0,01 М фосфатнымбуфером рН 7,2.Заполненные колонкипромывают средой 199 (среда 199 нарастворе Хенкса рН 7,2 культур клеток, АМН СССР, Институт полиомиелитаи вирусных энцефалитов, Москва,142782), обогащенной 5 Ф фетальнойсывороткой крупного рогатого скотаи 14 пенициллина, 1 Ф стрептомицина.На каждую колонку наносят по2 х 10 клеток из крови больных лейДля контроля через колонку, заполненную иммуносорбентом, пропускают лимфоциты крови здоровых коров Элюцию лимфоцитов проводят средой того же состава при той же скорости, как и при Фракционировании клеток из крови больных лейкоэом коров.Все клетки, не обладающие сродством к иммуносорбенту, проходили не задерживаясь (1 фракция), а клетки, обладающие сродством к иммуносор,бенту, сорбировались на колонке (11 фракция).В табл 1 представлены результаты разделения лимфоидных клеток крови больных лейкозом и здоровых животных методом аффинной хроматографии. Таблица 1 Количество элюированных клеток больных лейкозомкоров, 3 Количество элюированных клеток здоровых коров (контроль),о 4 Жизнеспособность,ф Жизнеспособность4 Клетки 98, 92,1+2,8 7,9+2,6 диной АС-Л(ЛЛ), кроличьей АС-К(ЛЛ) фв и бычьей АС-Б(ЛЛ).антисыворотками,приготовленными против лимфоцитовкрови больных лейкозом коров.Получили характеристики Фракционированных клеток.55 1 фракция 27;2-2, 1 11 Фракция 72,8+2,0 Как видно из данных табл. 1, основная масса лимфоцитов больных лейкозом животных задерживалась на колонке, что указывает на способность иммуносорбента специфически связывать лейкозные клетки.Для подтверждения того, что выделенные лимфоциты являются лейкозными, подвергали их исследованию в цитотоксическом тесте (ЦТТ) с лоша 5 4козом коров, суспендированных в 5 - 10 мл среды 199 с добавлением 5 фетальной сыворотки. Клетки в колонке инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.Для элюирования клеток, связанных с антителами на колонке, используют 1-ный раствор бычьего у -глобулина в среде 199 с 5 Ф-ной фетальной сывороткой (100 мл). Содержимое колонки помешивают пастеровской пипеткой. Элюированные клетки 3 - 4 раза промывают средой 199 и проверяют их жизнеспособность 0,05 раствором трипанного синего. В табл. 2 представлена цитотоксичность антисывороток на лимфоциты крови крупного рогатого скота.918855 6Та 6 пица 2 Цитотоксичность Лимфоциты больных лейкозом коров, Ф Антисы- воротки е1 Фракция П фракция Нефракцио фракций 11 фракция(нормаль лейкозные нированныеные) Нефракцио- нированные 1АС-Л(ЛЛ) 98,0+1,8 12 э 3+2 ф 2 12,6+1,7 79 2+5,8 12, 7+1, 4 7 3+0,5 О 7,8+0,5 97,6+1,3 13,2+2,1 АС-К (ЛЛ) 79, 8+4, 7 6,4+0,9 95 ф 5+2 ю 1 АС-Б(ЛЛ) 76,2+4,1 10,7+1, 3 11,0+2,0 формула изобретения ВНИИПИ Заказ 2129/27 Тираж 883 Подписноееее е е еее е ееееееееееее Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Как видно.из данных, представ" 20ленных в табл, 2, лимфоциты 11-ойфракции больных лейкоэом коров, полученные при использовании предлагаемого иммуносорбента, обладают высокой чувствительностью к цитотоксическому действию противолейкоэных сывороток по сравнению с цитотоксичностью на лимфоциты 1-ой фракции боль",ных лейкозом коров и с цитотоксицностью на нефракционированные лимфоциты. ЗОАналогичные данные полученные вреакции агглютинации, положительнаяреакция установлена только с лимфоцитами 11-ой фракции больных лейкозомживотных.35Результаты исследования культуральной жидкости и лизатов культивированных лимФОцитов в реации преципитации в агаре показали наличиеантигенов вируса лейкоза крупного ро-огатого скота в культурах лимфоцитов11-ой Фракции. При электроскопичес"ком исследовании фракционированныхклеток вируспродуцирующие лимфоцитыбыли обнаружены только в культурах11-ой фракции,Все данные указывают на способ"ность предлагаемого иммуносорбентаспецифически связывать лейкозные(трансформированные) лимфоциты иобеспечить получение жизнеспособныхлейкозных лимфоцитов для морфологи" Лимфоциты здоровых коров, Ф е ческих,биохимических и иммунологических исследований,1. Иммуносорбент для выделения лейкозно-измененных лимфоцитов из крови животных, содержащий сефадекс 6-200 и белок, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения селективности в отношении лейкозноизмененных клеток, в качестве белка используют г -глобулиновую фракцию, содержащую антитела, выделенные из сыворотки лошадей, иммунизированных лимфоцитами крови больных лейкозом коров.2, Иммуносорбент по и. 1, о т л ич а ю щ и й с я тем, что соотноше" ние осевшего неактивированного сефадекса Ъ =200(в мл)с 1-глобулиновой Фракцией (в мг) составляет 1:8- 1:6. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. А, Воуцв "3 яо 1 айюв оЕ пюлопцс 1 саг се 11 я апс 1 рапц 1 осуйея Ггсип1 шпип Ь 1 оой". "Бсапй. Л. С 1 п. ЕаЬ.1 пчезйф, 1968, ч, 21, я 97, .р.77 е 86.2, В.й, В 1 ооа, Э . ЕЛачЫ "Эй ч 1 йгопейЬхЬ л Се 11-МейайесГ апд Ъзпог,Зпапдпйу". нАсайеппс Ргеяь", МешсУог, 1976, р. 225-262.