Способ иммобилизации микросом печени

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУл У 22О.В. Севастьян С.А, Андронаткий .институт ни ле со ме Ф 113013, 75.идетельство. СС 0 11/18 198 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) (57) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем их ковалентного связывания на полиэтилене с привитым сополимером с помощью поперечносшивающего реагента, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью новьппея монооксигеказной активности цевого продукта и удешевления споба, в качестве привитого сополира используют полиаллиловый спирт в количестве 4-93, а.в качестве поперечно-сшивающего реагента - 15-35-ный п-бензохинон, причем массовое соотношение белка микросом и носителя составляет (0,3:10)- (1: 10) .161553 2 5 10 Цель изобретения - повышение монооксигеназной активности целевого продукта и удешевление способа получения иммобилизованных микросом,Поставленная цель достигаешься тем, что согласно способу иммобилизации микросом печени путем их ковалентного связывания на полиэтиленес привитьик сопопимером с помощью поперечно-сшивающего реагеита, в качестве привитого сополимера исполь 1 ,1Изобретение относится к биотех-,:нологии, в частности к способамполучения иммобилизованных микро. сом печени животных, и может бытьприменено в медицине и биохимиидля изучения метаболизма и ток, сического действия лекарственныхвеществ, в аналитической промышлен 1 ности (для создания ферментных элементов) в тонком органическом синтезе (для направленного полученияпродуктов окисления, обладающих оптической активностью),Известен способ иммобилизациимикросом печени, заключающийся вковалентном связывании с матрицейВгСЧ-активированной сефароэой Я .Недостатками данного способаявляются необходимость разделениямонооксигеназной системы микросомпечени на компоненты: цитохромР, НЬДФН-зависимую редуктазуи фосфатидилхолин перед иммобилизацией для получения стабильногопродукта, обладающего активностью,так как при иммобилизации самойсистемы микросом наблюдается полное исчезновение монооксигеназнойактивности, низкая активность и стабильность целевого продукта.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ иммобилизации микросомпечени путем их ковалентного связывания на полиэтилене с привитым сополимером с помощью попвречно-сшивающего реагента, в качестве привитого сополимера используют полиакриловую кислоту в количестве 6-10%,а в качестве поперечно-сшивающегореагента карбодиимид 23Недостатками способа являетсянизкая активность монооксигеиаэыу целевого продукта (25% от исходной). а также необходимость использования дорогостоящего карбодиимида. 30 ЗЗ 40 45 50 Я зуют полиаллиловый спирт в количестве 4-97, а в качестве поперечно-сшивающего реагента 15-357-ный и-бензохинон,причем массовое соотношение белок микросом и носителя составляет (0,3: 10) -(1: 10) .Сущность способа заключается в использовании полиаллилового спирта в количестве 4-9% в качестве привитого сополимера и 15-557,-ный и-бензохинона в качестве поперечно-сшивающего реагента. Преимущества при этом возникают как за счет изменения структуры полимера, так и вследствиеувеличения расстояния от микросом доматрицы при замене карбодиимида на бензохинон. Важным параметром приэтом является соотношение белок микросом: носитель, которое должно бытьв диапазоне от (0,3: 10)-(1: 10) . Монооксигеназная активность в указанноминтервале соотношений максимальна(таблица 1), при соотношении 1,25: 10значение активности также несущественно изменяется, однако при этомрезко падает процент связывания белка микросом, При весовом соотношении 0,2;10 монооксигеназная активность составляет 70%, В таблице приведены также возможные интервалы параметров, касающихся концентрации и-бензохинона и полиаллилового спирта.Оптимальное значение количества привитого полиаллилового спирта составляет 4-97, Yри использовании носителя с 2% полиаллилового спирта монооксигеназная активность составляет 58-597 от максимальной, верхний предел (97) полиаллилового спирта обусловлен воэможностями метода радиационной прививки. Использование низких концентраций и-бензохннона приводит к снижению активности препарата, а его увеличение свыше 35% нецелесообразно,Способ позволяет полностью сохранить монооксигеназную активность целевого продукта и удешевить процесс за счет использования доступного поперечно-сшивающего реагента.П р им е р 1. Активация полиэтилена с 5,6% привитого полиаллилового спирта осуществляется следующим образом. К 9,0 г полиэтилена с 5,67 привитого полиаллилового спирта в 560 мл 0,1 М КН РО, /ИаОН буфера, рН 8,0 (комнатная температура, перемешивание на магнитной1161553 Иммобилизовайную фракцию микросом35 суспендируют в буфере А, рН 7,4.Монооксигеназная активность по анилину 6,66 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Рв мин при 37 С (сохранение активности в 7 от исход 40 ной 142,67) в присутствии гидроперекиси кумола 0,49 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Рв минопри 37 С (сохранение активности от исходной - 207, 17) в присутствии45 НАДФН генерирующей системы и Ог и 0,77 нмоль субстрата/нмоль цито- хрома Рв мин при 37 С (сохранение активности от исходной 257,2 Е) в присутствии НАДФН и О 3мешалке) добавляют 139 мл 0,25 М раствора и-бензохинона в 967-ном этаноле. Суспензию перемешивают 1 ч при комнатной температуре, затем переносят на воронку Бюхнера и промывают 203-ным этанолом, дистиллированной водой, 1 М ИаСВ и сно ва дистиллированной водой.Используют нативные микросомы со следующими характеристиками: выход микросомального белка 24,5 мг белка/г печени, активность по анилину 4,7 нмоль субстрата/нмоль ци" тохрома Рв мин при 37 С.1 г полученного полиэтилена с привитым полиаллиловым спиртом, активированным п-бензохинономЭ суспендируют в охлажденном буфере А, рН 8,0 (О, 1 М КНРО /ИаОН) со 100 М КСЕ, 1 М ЭДТА, 1 М дити - треитола, приготовленном на 207-ном (по объему) глицерине. При перемешивании на магнитной мешалке к суспензии носителя добавляют суспензню фракции микросом, содержащую 30 мг белка. Полученную суспензию инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке 24 ч при 4-5 оСЯ У ,затем промывают на воронке Бюхнера буфером Б, рН 7,4 (О, 1 М КН Р(/НаОН) с 0,5 М КС 1, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола, приготовленном на 207.-ном глицерине, а затем аналогичным буфером без КСВ . 4Иммобилизованные по данному способу микросомы стабильны при хранении в течение 6 мес при 4-5 С,за это время падение монооксигеназной активности составляет 20.Температурный оптимум микросомпечени, иммобилизованных на полиэтилене с привитым полиаллиловымоспиртом 37 С, а рН - оптимум - 7,6.1 О П р и м е р 2. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1.,Отличие заключается лишь в том,что к 1 г полиэтилена с привитым полиаллиловым спиртом, активированным 15 п-бензохиноном, добавляют при перемешивании суспензию фракции микросом, содержащую 100 мг белка.Монооксигеназная активность поанилину 6,90 нмоль субстрата/нмольцитохрома Рв мин при 37 С (сохранение активности в Е от исходной147,6) в присутствии гидроперекисикумола, 0,51 нмоль субстрата/нмольцитохрома Рв мин при 37 С 25 (сохранение активности в Х от исходной - 2 14,6) в присутствииНАДФН - генерирующей системы и 0ги 0,80 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Рв мин при 37 С (сохранение активности в Х от иходкой266,5) в присутствии НАДФН и О, .Применение предлагаемого способапозволяет отказаться от использования дорогого и сложно синтезируемо"го карбодиимида-1-циклогексил-(2-морфоминоэтил)карбодиимид-метотолуолсульфоната и заменить егоболее доступным и дешевым и-бензохиноном, что значительно упрощаети удешевляет способ иммобилизации.Использование предлагаемого способа иммобилизации позволяет повысить моноксигеказкую активность до142-148 вместо 253 в прототипе (вприсутствии гидроперекиск кумола)207-2153 (в присутствии НАДФН генерирующей системы и 0 ) и 257-2673(в присутствии НАДФН и 0,).Способ прост в осуществлении,не требует особых условий при модификации носителя.1161553 Количествобензохинона,вес.Х Весовое соотношение белок микросом:носитель Количество привитого полиаллилового спирта, вес.Х Моноокснгенаэнаяактивность иммобилизованных микросом,нмоль субстрата/нмоль цитохрома Рв мин при37 С 3,9 0,3:10 0,3:10 0,3;10 1:10 1:10 1:10 0,2:10 0,3:10 1:10 14,9 6,3 6,5 35,2 4.14,9 4,8 20,8 20,8 6,7 6,9 1,25 ф 10 20,8 5,6 6,8 1:1 О 10,4 1:10 Тирам 525 Подписное ЭЯИЙПИ Государственного комитета СССР по делам изЬбретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 475