@ -нитроанилиды пироглутамилсодержащих пептидов в качестве субстратов сериновых протеиназ

(54) и-НИТ СОДЕРЖАЩИХ СТРАТОВ СЕ ,(57) и-Ни содержащий Ь-рбаРОГЛУТАМИЛКАЧЕСТВЕ СУЕИНАЗ .роглутамилрмулы ОАН ИЛИДЖЕ ПЕПТИДОВ ИНОВЬК П троанилидыпептидов А-А-В -НР),ф сост ных где АВ о СгтгаСев 977,лейцина или Ь-феУтов сериновых протаток Ь лаланин субстр тв качин ва Лан.хтидныанал Д.,мия) СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК (9) П 1) ГОСУДАРСТВЕННЬЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1. Роввкау М., Оавраг В.,Е 1 оИ Р. ХпевС 1 ваСЬопв оп пем,субстратов субтилизина и их аток глицина или Ь-алани102509 55 65 Предлагаются новые хромогенные производные пептидов, которые могут использоваться в качестве субстра,тов при определении активности протеолитических ферментов, относящихся к сериновым протеиназам. Они могут 5 найти применение в медицине, пищевой промышленности, микробиологии.Для определения активности Ферментов удобно использовать производные пептидов, содержащие хромофорную 10 группу, что позволяет следить за ходом расщепления субстрата по изменению окраски раствора спектрофотометрически. В качестве таких хромофорных субстратов описано использование и-нитроанилидов Г 1 32-01 уРго, Е-А 1 а-Рго-Ьец, Е-А 1 аЬец, 2-01 у-Рго-Ьец, Е-Азр-Рго-Ьец, Е-А 1 а-уа 1-Агд, Е-ЬуБ-Ьец-Аг.Известно использование в качестве субстратов для субтилиэина ВРИ-производных пептидов общей формулы где Е - бензилоксикарбонильнаягруппа,А и В- остатки глицина или Ь-аланина;С - остатки. Ь-лейцина илиЬ-фенилаланина. 30 Разница в положении максимума поглощения этих производных (315 нм) и максимума поглощения п-нитроаналина, отщепляющегося в процессе ферментативного гидролиза (375 нм), по зволяет следить за ходом гидролиза спектрофотометрически Ь 23.Однако наличие гидрофобных групп приводит к плохой растворимости этих соединений в воде, .Поэтому их приме нение возможно только в водно-органических растворах,а присутствие органического растворителя (в данном случае диметилформамида) неблагоприятно влияет на каталити ческую активность ферментов, оказывая ингибирующее действие. Такимобразом, область применения описанных субстратов достаточно ограничена, и их использование не дает истинных значений удельной активности ферментов.Целью изобретения является повышение эффективности субстратов, расширение области их применения.Поставленная цель достигается описываемыми и-нитроанилидами пироглутамилсодержащих пептидов общей Формулы Ь-рб(и-А - А - З - ИН , / М 8 60 где А -остаток глицина или (,-ала. нина;Востаток-лейцина или 1;Фенилаланина,которые обладают более высокой растворимостью в воде по сравнению сизвестными соединениями. Это позволяет снизить концентрацию диметилформамида при проведении Ферментативной реакции с этими производными от 20 (в случае бензилоксикарбониль. ных производных) до 4 (для глицинсОдержащих пироглутамилпроизводных) и до 0,2 (в случае аланинсодержащих пироглутамилпроизводных), Такое содержание органического растворителя не оказывает заметного ингибирующего действия на протеолитические Ферменты.и-Нитроанилиды пироглутамилпептндов укаэанной:общей формулы получают конденсацией в присутствии дициклогексилкарбодиимида пироглутамилпептида р 01 ц-А-А и и-нитроанилида Ь-лейцина или и-нитроаналида Ь-фенилаланина. Если А - остаток Ь-аланина, в реакционную смесь добавляют Б-оксисукцинимид. П р и м е р . и-Нитроанилид 1-пи- роглутамил-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-лейцина.0,2 г (0,74 ммоль) ь-пироглутамил-Ь-.аланил-Ь-аланина и 0,018 г (0,74 ммоль) и-нитроанилида Ь-лейцина растворяют в 10 мл абсолютного диметилформамида. К раствору при 0 С и при перемешивании добавляют 0,08 г (0,74 ммоль) Б-оксисукциними-да и раствор 0,2 г (0,9 ммоль)Н,И(- дициклогексакарбодимида в 5 мп абсолютного диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч прио0 С, затем 20 ч при комнатной температуре. Отделяют осадок фильтрованием, Фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют при слабом нагревании в 5 мл и -бутилового спирта, затем прибавляют 10 мл этил-. ацетата и смесь оставляют на холоду иа 24 ч. Отфильтровывают М,Н-дициклогексиломочевину, объем раствора доводят до 20 мл, добавляя 5 мл ибутилового спирта, и раствор промывают 1-ным раствором бикарбоната натрия (2 5 мл) и водой (25 мл). Высушивают раствор над 02804 и упарйвают в вакууме досуха. Остаток кристаллизуют под эфиром и пере= кристаллизовывают из спирта, выход 0,22 г (60), т.пл.261-264 С 1 с 3 -16 (с 0,5, диметилформамид).Найдено, : С 54,18; 54,22 ф Н 6,25 6,.45; И 16,23 16,30.С 2 Н 2ОУВычислено. : С 54,75; Н 6,39; Б 16,16. Аналогично получают и-нитроанилид Ь-пироглутамил-Ь-аланил-Ь-Фенилаланина, выход 50, т,пл.213-217 С, ГЫ 321 о -16 (с 0,5, диметилформамид) .1025091 Таблица 1Удельная активность субтилизина ВРИ по пептидным микромольсубстратаиф мии.опт.ед.фермента ЛиметилФоомамид.Ъщ щщешщ ещв щещш щеш ш щШш20 10 4 1Ш Шщ шщ Субстрат щЪ-Ь(а-Ь - 0(а-Ь - Ьеи -МНВОе 1, 3х)Ь-рбйи - Ь - а 1 а-с.-аа-Е. - с ец-ИНМО о,з 8Ь-риац-Орла-Ь-О 1 а-С,-РЛе-ИНМое о,озщщщФ ве ищщ щщ ее а емщв 0,008-1-О(а-О(а-Ь-Ьеи 0,20 0,0 еиНайдено,%: С 58,20; 58,12; Н 5,65;5,65 и 15,12, 15,07,ЪьНяо" ь О 1Вычислено, Ъ: С 59,97; Н 5,62,н 15,61.Также получают и-нитроанилид ь-пнроглутамилглицилглицил-ь-фенилаланина, .выход 59, т.пл.165-170 С,а 3+16 ф(с 0,5 диметилформамид) .Найдено,%: С 56,61; 56,70; Н 5,21;5,23;0 16,08, 1 ОЪ"гь" ь оВычислено.%: С 56,45; Н 5,15;Б 16,46.Синтезированные и-нитроанилиды пироглутамилпептидов испольэовали в качестве субстратов при определениипротеолитической активности субтилизина ВРИ,о-химотрипсина,эластазы,про. -теиназы из ТегвоасФ 1 поаусев уц 1 цаг 1 е.Значения удельной активности этих.Ферментов, определенной по полученным 2 О субстратам и по субстратам, описанным ранее, приведены в табл.1, 2, 3 и 4.Йэ таблиц видно, что изменение концентрации органического растворителя существенно влияет на скорость ферментативного гидролиэа. Так,для субтилизина ВРИ при уменьшении концентрации диметилформамида в 20 раз удельная активность фермента,.определяемая по синтезированным субстратам, возрастает в 8 раз, удельная активность зластаэы при снижении кон" центрации диметилфорамида от 20 до 1 возрастает в 9 раз.Хорошая растворимость синтезированных и-нитроанилидов пироглутамилпептидов в воде открывает широкие воэможности использования их в знзимологии в качестве реагентов, а также в промышленности и медицине при определении содержания Ферментов./ 3,6 1,5 0,06 0;08 0,008 Т а б л и ц а 3 Удельная активность эластазы, микромоль мин.опт.ед.фермента Диметилформамид,% Субстрат х)Е- Орла -6- 0(а-Е.-ахеи - ОН УО,0,04 Ь-рСи - . - аойа-.-ем-ННо,0,04 Оф 12 0,36 Т а б л и ц а 4 Удельная активность сериновой протеиназы изТегаоасС 1 повусез Чц 18 агху, мик омольмин.опт.ед.фермента Диметилформамид,Ъ Субстрат Мх-Ь-аа-ь -аа-Ь-ьеа-Ин маГ6-рИ ц -6-0(а. - 0 а - 6. - Е, еи - ИН . 00 С 3, 9Е;РИц - Е, - О(а- 0(а-Е - Р 11 е-ФН МО 6,03,0 23 юб 108,7 76,7 29,7 ВНИИПИ Заказ 1141/5 Тираж 410 Подписное веююююеефее Ю Ю ЮВ Ю вавиле ееееюЕЕаее ае ею филиал ШШ "Патент, г. Уагород, ул. Провткиая,4 М Субстраты с бензилоксикарбонильной защитной группсй, описанные ранее Г 23,