Способ идентификации галофильных вибрионов

ИСАНИЕ РЕТ ЕЛЬСТВ СПОСОБ ИДЕНТИФИ ВИБРИОНОВ путем мого материала н е, отличаю ,с целью ускорени оба, выращивание ствии фага ЧдЪг 1 о 531, Ч 1 Ьго а 18 дп или ЧЪгъо а 18 дпо 1 ус 3496554/28-13,У 42 А.Е. Либинзон 8.8)ческая и лабораолеры (краткоеское книжное ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТН К АВТОРСКОМУ. Известен способ идентификациигалофильных вибрионов путем выращи 5вания исследуемого материала на питательной среде с последующим пересевом и идентификацией по биохимическим тестам Г 13Однако известный способ длителени сложен в. осуществлении, так какмногоэтажен, требует набора индика-торных питательных сред.Цель изобретения - ускорение иупрощение способа,Цель достигается тем, что согласно способу идентификации галофильныхвибрионов путем выращивания исследуемого материала на питательной среде,выращивание осуществляют в присутствии фага 71 Ъг 1 о а 18 жо 1 уЫсцз 531,71 Ьгхо а 1 упо 1 уС 1 сцз 337 и/илиЧЬг 1 о а 18 дпо 1 усцз 532.Фаг 71 Ъг 1 о а 18 дпо 1 уйхсцз 531 выделен при исследовании мидий, выловленных в Севастопольской бухте. Фаг71 Ьго а 18 дпо 1 уг 1 сцз 531 хранится вколлекции бактериофагов ТбилисскогоНИИВС МЗ СССР под номером Фихарактеризуется следующими признака 30Морфологические и культуральныесвойства.Головка вибрионов фага 71 Ьг 1 оа 181 по 1 уг 1 сцз имеет в проекциигексагональную форму размером 35806 А 1 18 А " 740 119 А. Длина оторостка 1271 +31 А,его диаметр277 + 18 А. Доверительные интервалысредних величин определены для уровня достоверно .ти, равного 997.(р = 0,01) .фаг 531 с сокращающимся чехломотростка, относится к 5-й морфологической группе по классификацииА.С. Тихоненко. 45Фаг 531 активно репродуцируетсяна клетках индикаторного штаммаЧьЪгъо а 18 по 1 уЫсцз 434 в щелочном бульоне и бульоне Мартена с ЗЕЮаС 1 при 37 С. При посевной дозе 50фага .2 10 мл и множественностиинфекции - 10 в течение 6 ч в 1 млсреды накапливается 6 10 вибрионов.ДНегативные колонии фага 531 воспроизводятся с помощью двуслойного 55метода Грациа, в качестве нижнегоплотного слоя. используют щелочной2 Х-ный агар Мартена с ЗХ ИаС 1 или 30 2другие щелочные среды для выцеления вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова) сповышенной концентрацией соли. Напластинки плотного агара выливаютвторым слоем смесь расплавленного иохлажденного до 45 С 0,7-ного агара Мартена с 2 ЯаС 1, 2-3 часовой,бульонной культуры индикаторногоштамма и 50-100 вибрионов фага вО, 1 мл среды. Через 16-18 ч при20-25 С фибрионы фага 531 образуютв мягком слое агара с индикаторнойкультурой ЧдЬгко а 18 ию 1 уг 1 сцз 4892мутные колонии округлой формы диаметром 3-4 мм.При нанесении капли фага 531 нагазон индикаторного штамма непосредственно на плотном агареили в слое мягкого агара наблюдается неполный лиэис.Фаг 531 полностью нейтрализуетсягомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и другихвибрионов.Фаг ЧЬг 1 о а 181 поЕус 1 сцз 531 вконцентрации 8 10 з лизирует 157 испытанных культур галофильных вибрионов, нелизирующихся фагамн 337 и532. Фаг обладает высокой специфичностью в отношении галофильных вибрионов и не лиэирует вибрионы видаЧЪг 1 о сЬо 1 егае 01 и не01 группы,а также микроорганизмы других родови семейств: Аегошопаз, Апаегоеепез,Езспег 1 сИа соИ, Рзецдошопаз.Аегц 81 поза. На этом основании фагможет быть использован для индентификации галофильных вибрионов какв составе поливалентного препарата,так и для фаготипирования в качествемонофага,Штамм фага 71 Ьгдо а 18 ьпо 1 уг 1 сцз337 вьделен при исследовании краба,выловленного в Севастопольской бухте,Штамм фага ИЪпо а 18 дпо 1 уйсцз337 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР подномером Фи характеризуется следующими признаками.Морфологические и культуральныесвойства.Головка вибриона фага 337 в проекции имеет гексагональную форму,размерами 57445 530 + 42 А, Дли124030 Ю 1 О Ю 25 1 О 35 40 45 50 55 3 1 на отростка 103 й 22 А. Доверительные интервалы средних величин опре" делены для уровня достоверности, равного 997. (р = 0;01). Фаг 337. с. коротким отростком и относится к 3-й морфологической группе по классификации А.С, Тихоненко.Фаг 337 активно репродуцируется в щелочном бульоне Мартена (рН 7,6- 7,8) с ЗХ НаС 1 на клетках индикаторного штамма Ч 1 Ъг 1 о а 181 по 1 уС 1 сцз И 262. При посевной дозе фага 5 10 и множественности инфекции 5 через 3,5 ч нри 35-37 С в 1 мл среды накапливается 2 10 вибрионов. НегаЭтивные колонии фага 337 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного слоя используют щелочной 2 Х-ный агар Мартена с 37 ЯаС 1 или. другие щелочные среды для вьщеления вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова), На пластинки плотного агара выпивают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 С 0,7%-ного Мартена с 2 Е ИаС 1, с 0,2 мл 2-3 часовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50- 100 вибрионов фага в 0,1 мл бульона. Через 16-18 ч при 20-25 С вибрионы фага 337 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой ИЬго а 181 по 1 уйдсиз 262 негативные колонии округлой формы с прозрачным центром и узким мутным ободком по периферии.При нанесении капли фага 337 на газониндикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое мягкого агара происходит полный лизис культуры.Фаг Ч 1 Ьгю а 18 дпо 1 уС 1 сиз 337 полностью нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов, обладает узким диапазоном и лизйрует ЗЖ культур галофильных . вибрионов, не лизирующихся другими фагами. Фаг специфичен и не лизирует представителей вида ЧдЬго сЬо 1 егае 0,1 ине 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Аегопюпаз апаегояепез, ЕзсЪег 1 сЫа соТ 1, Рзеш 1 опюпаз аегц 8 дпоза. На этом основании фаг может быть использован для идентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирования в качестве монофага.Штамм фага Ч 1 Ъго а 1 хпо 1 уТсцз 532 вьщелен при исследовании мидий, выловленных в Севастопольской бухте.Фаг ЧЗ.Ьгдо а 181 поХуйдсцз 532 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номе" ром Фи характеризуется следующими признаками.Морфологические и культуральные свойства.Головка вибрионов фага 532 имеет в проекции гексагональную форму, размером 1138 1 65 А 1062 1 64 Х Длина отростка 2599 ф 162 1, ширина 270 + 11 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уровня достоверности, равного 997 (р = 0,01) . Фаг 532 с сокращающимся чехлом отростка относится к 5-й морфологической группе по Т.И. Тихоненко.Фаг 532 активно редродуцируется на клетках индикаторного штамма ЧдЬгдо а 181 по 1 уйсцз 532 с щелочном бульоне Мартена с 2-37. ИаС 1 при 35-37 фС. При посевной дозе фага10 мл среды и множественнос 5ти инфекции 1/15 в течение 3,5 ч в 1 мл среды накапливается 1,5 .10 вибрионов фага.Негативные колонии фага 532 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного слоя используют щелочной 27.-ный агар Мартена с ЗХ ИаС 1 или другие плотные щелочные среды для вьщеления вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока илн в Московском институте вакцин и сывороток им, Мечникова) с повышенной кон центрацией соли. На пластинки плотного агара выпивают вторым слоемсмесь расплавленного и охлажденного до 45 С 0,7 Х-ного агара Мартена с 27 ИаС 1, 0,2 мл 2-3-чаФсовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в 0,1 мл среды. Через16-18 ч при 20-25 С вибрионы фага 532 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой ЧЪг 1 оа 18 по 1 уйсцз 532 колонии округлой1 Составитель Г. СмирноваТехред С.Мигунова Корректор В. Гирняк Редактор М, Дылын Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д, 4/5Заказ 8208/24 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная 4 3 11 формы с прозрачным центром и мутной периферией, диаметром 2-3 мм.При нанесении капли фага 532 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотной среде или в мягком слое агара наблюдается ливис культуры.фаг ЧЬгхо а 1 дЫо 1 усцв 532 полностЬю нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов. Фаг ЧЬгхо а 1 дЫо 1 уйсцв 532 ли- зирует 40% испытанных культур Чь.Ьгз.о а 18 хпо 1 уесцв и обладает вы" сокой специфичностью в отношении гальфильных вибрионов, Он не лизирует вибрионы вида ЙЬго сЬь 1 егае . 01 и не 01 группы, а,также микроорганизМы других родов и семейств: . Аегошопавапаегояепез, ЕвсЬегсМа со 1 х, Рвецйошопав аегцдпова. В связи с этим он может. быть использован для идентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для Фаготипирова" ния в качестве мопофага.П р и м е р 1. Использование фага Ч 1 Ьгхо а 1 дпо 1 уй 1 сцв 531 для идентификации культур галофильных вибрионов.Из испражнений больного острой кишечной инфекцией, подозритель- . ной по клиническому течению на забо левание, вызванное галофильными вибрионами, была вьделена культура грамотрицательных бактерий. Идентификацию этой культуры с помощью Фага ИЬг 1 о аХдпо 1 уйхсцв 531 проводят следующим образом.Культуру засевают в бульон Мартена с 3% ВаС 1 и помещают в термостат на 3 ч. 0,2 мл выросшей культуры смешивают с 5 мл расплавленного 24030 6и охлажденного до 45 фС 0,7%-ного агара Мартена с 2% БаС 1 и наливают вторым слоем на пластинки 2%-ного агара Мартена с 3% ЯаС 1 в чашках Петри.5 После подсушивания на поверхностьмягкого агара с культурой наносят,стерильной пипеткой каплю фагаИЪгдо а 1 дЫо 1 усцв 531. Посевыоставляют при комнатной температуре.10 Через 18 ч на месте нанесения каплифага наблюдают просветление газонакультуры, свидетельствующее о еерастворении. Ливис изучаемой культуры под действием фага ЧдЬгдо а 1 ддпо 1 угтсцв 531 позволяетидентифицировать ее как галофильный вибрион,П р и и е р 2. Вьделенная культура не лизировалась фагом ЧдЪгоа 1 ддпо 1 уСсцв 531. По методике, 20 описанной в примере 1, была определена ее чувствительность к фагу 337,Ливис изучаемой культуры под действием фага ИЬгю а 18 дпо 1 уй 1 сцв 337свидетельствует о ее принадлежности 25 к галофильным вибрионам.П р и м е р 3, Выделенная культура не лизируется ни одним из фагов ЧЬго а 1 фпо 1 уй 1 сцв (531 и337). По методике, описанной в при(. мере 1, была определена ее чувствительность к фагу ИЬго а 1 дпо 1 уйхсцв 532. Ливис изучаемой культуры под действием фага ЧЬго а 1 дхпо 1 угсцв 532 свидетельствует о еепринадлежности к галофильным вибрионамеАналогичным образом бьцти идентиФицированы культуры, выделенные изморской воды и гидробионтов, а так 4 о жеопределена чувствительность музейных культур к фагам 531, 337,532.Использование предложенного спо- ., соба позволит в короткие сроки проводить идентификацию галофнльньпс ц 5 вибрионов менее трудоемким способом.