Способ идентификации галофильных вибрионов

) С 12 Я 1 00:. ГОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1. Микробиология и лабораторнаядиагностика холеры (Краткое руковод"ство). Ростовское книжное нзд., 1975,с. 42-43,(54)(57) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАЛОФИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ путем посева исследуемого материала на питательную среду, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения способа,идентификацию проводят методом фаготипирования с использованием фага7 дЬг 1.о рагаЬаешоТуйсцз 333 и/или7 дбгдо рагаЬаешо 1 усьсиз 375.в Иркутском ПЧИ Сибири и ДальнегоВостока или в Московском институтевакцин и сывороток им. Мечникова)с повышенной концентрацией соли. Напластинки плотного агара выливаютвторым слоем смесь расплавленногои. охлажденного до 45 С 0,77. агараМартена с 27. ИаСХ, 2-3 часовой 0,1 мп среды. Через .16-18 ч при 2025 С вибрионы фага 333 образуют в культурой Ч, рагаЬаешоХугхспв 3421 Фкруглые полупрозрачные негативные колонии диаметром 1,5-2 мм.При нанесении капли фага 333 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое мягкого агара наблюдается фаг 333 полностью нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетекультур галофильных вибрионов нелизирует 157 испытанных культургалофильных вибрионов, не лизируюдругих родов и семейств: Аегоаопав апаегодепев, ЕвспегзсМв соИ,Рвецйошопав аегафпова, На этом основании фаг может быть использовандля идентификации галофильныхвибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирования в качестве монофага.фаг ЧЬгхо рагаЬаешоЕуесив 375выделен при исследовании мидий, выловленных в Севастопольской бухте.Фаг ИЬгдо рагаЬаешо 1 уЫсцв 375 хранятся в коллекции бактериофагов Тбилис"ского НИИВС МЗ СССР нод номеромфи характеризуется следующимипризнаками,Морфологические и культуральныесвойства.Головка вибрионов фага 375 впроекции имеет гексагояальную формуразмером 660 37 660 + 42 А,Длинаотростка 787 + 57 1, а его диаметр22 б ф 49 А, Доверительные интервалысредних величин определены для проверки уровня достоверности, равного 1 1124031 2Изобретение относится .к медицинской микробиологии, а именно к лабораторной диагностике гальфильяыхвибрионов,Известен способ ццентификациигалофильных вибрионов путем посева5исследуемого материала на питательную среду с последующей идентификацией по биохимическим тестам 1. бульонной культуры индикаторногоОднако известный способ трудоем О штамма и 50-100 вибрионов фага вкнй, так как является многоэтажными требует .пересевов на ряд питательных сред для определения биохими- мягком слое агара с индикаторнойческой активности,Целью изобретения является упроще ние способа.Цель достигается тем, что соглас.- но способу идентификации галофильных вибрионов путем посева исследуемого материала на питательную средуидентификацию проводят методомфаго- ливис со вторичным ростом.типирования с использованием формаЧхЬгьо рагаЬаешоХугсав 333 и/илиЧХЬгхо рагаЬаешоХуйсив 375.Фаг ЧхЬге рагаЬаешоХугхспв 333 : рологичным фагам галофильных и друвыделен при исследовании краба, гих вибрионов.выловленного в Севастопольской бухте. Фаг 333 лизирует 157 испытанныхфаг Ч 1 Ьгхо рагаЬаешоХуй 1.спв 333хранится в коллекции бактериофаговТбилисского НИИВС МЗ СССР под номером .фи характеризуется следующимищихся Фагом 375 и другими фагами,свойствами специфичен и не лизирует представиМорфологические и культуральныетелей вида Ч. сЬоХегае 01 и не 01свойствагруппы, а также микроорганизмыГоловка вибрионов Фага 333 впроекции имеет гексагональную Форму размерами 613+ 63576+ 53 1,длина отростка 126 +24 А. Доверительные интервалы средних величинопределены для уровня достоверности, равного 997 (р =" О, 01). Фаг с 1 Окоротким отростком и относится к3 морфологической группе по класси. Фикации А.С. Тихоненко,, фаг ЧхЬго рагаЬаешоХуйхсы 333активно репродуцируется в щелочном. бульоне Мартена с 2-37 ИаС 1 (рН 7,77,8), при посевной дозе Фага5 10 в мл среды н множественностиинфекции - 1,4, через 3,5 ч при 3537 С в 1 мл среды накапливается7 10 вибрионов,Негативные колонии Фага 333 воспроизводятся с помощью двуслойногометода Грациа. В качестве нижнегоплотного слоя используют щелочной 552 Е агар Мартена с ЗХ НаС 1 или дру.гие плотные щелочные среды для выделения вибрионов (изготовленные50 ВНИИБИ Заказ 8208/24 Тираж 521 Подписное Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4 3990 (р = 0,01), Фаг. с сокращающимся чехлом отростка и относится к 5 морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко.Фаг 7 Ьго рагаЬаешо 1 усив 375 активно репродуцируется в щелочном бульоне Мартена с 3% ИаС 1 (рН 7.6- 7,8) при посевной дозе фага 3 10 мл среды и множественности инфекции, равной 2, через 3,5 ч при 35-37 С в 1 мл среды накапливается 2 10" виб" рионов.Негативные колонии Фага 375 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного слоя используют для выделения вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова) с повышенной концентрацией соли. На пластинки плотного агара выпивают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 С 0,7% агара Мартена с 2% ЮаС 1, 2-3-часовой бульонной культуры индикаторного штамма (0,2 мл) 50-100 вирионов фага в 0,1 мл среды. Через 16-18 ч при 20-25 С вирионы фага 375 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой 7 Ьг 3.о рагаЬаешо 1 уссцв Зб 0 негативные колонии округлой Формы, мутные, 1,5-2 мм в диаметре.. При нанесении капли фага 375 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое мягкого агара наблюдается лиэис. Фаг 7 хЬго рагаЬаешоЕуИсив 375 аолностью нейтрализуется гомологичиой сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к другим фагам гальфиль. иых и других вибрионов, лиэирует 4.4% культур парагемолитнческих . вибуионов.Фаг специфичен и не лизи- рует представителей вида Ч. сЬоЕегае 01 и не 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Аегошопав апаегояепев, ЕвсЬегсЬдасо 1, Рвеийошопав аегп 8 пова.На этом основании фаг может быть использован для идентификации галофильных Вибрионов как в составе поливалентного 10 15 4 С 4препарата,так и для фаготипирования в качестве монофага.П р и м е р 1. Использование фага ЧЬго рагаЬаешо 1 уЕдсов 333 для идентификации культур галофильнык вибрионов.Иэ испражнений бального острой кишечной инфекцией, подозрительной по плиническому течению на заболевание, вызванное галофильными вибрионами, была вьщелена культура грамотрицательных бактерий. Идентификацию этой культуры с помощью фага Ч. рагаЬаешо 1 уйхсов 333 проводят следующим образом, Культуру засевают в бульон Мартена с 3% КаС 1 и помещают в.термастат на 3 ч 0,2 мл выросшей культуры смешивают с 5 мл расплавленного и охлажденного до 45 С 0,7% агара Мартена с 2% НаС 1 и наливают вторым слоем на пластин" ки 2% агара Мартена с 3% ЯаС 1 в чашках Петри. После подсушивания на поверхность мягкого агара с культурой наносят стерильной пипеткой каплю Фага Ч. рагаЬаешо 1 УИсцв 333. Посев оставляют при комнатной температуре.При просмотре чашки через 18 ч на месте нанесения капли Фага наблюдается просветление газона культуры, свидетельствующее о ее растворении. Ливис изучаемой культуры под действием фага 7, рагаЬаешо 1 УИспв позволяет идентифицировать ее как галофильный вибрион.П р и м е р 2. Выделенная культура не лиэировалась фагом 7, рагаЬаешо 1 уг 3.сив 333. По методике, описаннойв примере 1, определена ее чувствительность к Фагу. 375.Ливис изучаемой культуры под действием фага 7. рагаЬаешоХугсчв 375 позволяет идентифицировать ее как галофильного вибриона.Аналогичным образом были идентиФицированы культуры, выделенные из морской воды и гидробионтов, а также определена, чувствительность музейных культур к фагам 333 и 375,Использование предложенного способа позволяет упростить идентификапию галофильных вибрионов.