Способ получения гемолизина

СОЮЗ 009 ЯТСНИХййй сииРЕСПУБЛИК эае С 2 Я 1100 ГОСУДЮфСТВЕННЫЙ КОЮПЖТ ССОРи двмм Нвюпна н баНПЕОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯн двчоранае саидпввсъм(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕИОЛИЗИНАпутем выращивания гемолизинпродуцирующего ютамма.в жидкой питательнойсреде с последующнм отделением жидкойфазы, содержащей целевой продукт,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повыщения выхода гемолизина,используют ютамм ЧъЬго Яая Р,а выращивание ведут на среде, содер-.жащей экстракт. дрожжей с 30 мг Хаминного азота и О,ЗХ глицерина.женин кроликов-сосунов НАГ-вибрионы в дозе и" не вызывают особых патологических изменений.Штамм несет хромосомальную мутацию к рифампицинорезистентности (более 100 мкг/мл), которая является с одной стороны, его селективным маркером, а с .другой способствует лучшей эксперсии исследуемого признака. Так, установлено, что гемолитическая активность устойчивых клонов штамма с вероятностью 0,95 вьппе 63 1, 5/594,9 - 668, 1/ по сравнению с чувствительными 562,5/530.9-594,1).Штамм Ч.Иая характеризуется выраженной гемолитической активностью и не обладает гемолизин-дест- руктивным Фактором (энтеротоксином) . При сравнительном изучении продукции гемолизина в различных жицких питательных средах сказалось, что в пептоновой воде ее практически не наблюдается. В бульонах Мартена, Хоттияге= ра и казеоново-ферментативяом гемолитическая активность очень низкая, тогда как в дрожжевой (30 мг 7. амин- ного азота) отмечается стимуляция этой активности.Продукция гемолизина клетками Рв жидких питательных средах (37 , рН 7,8, 24 ч инкубации)Гемолитическая активность,ед/мл культуржидкости8,07,0 Бульон МартенаБульон ХоттингераБульон казеиново -ферментативный .2,0 Бульон дрожжевой 34,0 17-ная пептоноваявода 1,0 Получение гемолизияа иэ клеток предлагаемого штамма продуцента осуществляют.следующим образом,П р и м е р, Взвесь 18 ч агаровой культуры (агар Мартена, рН 7,6) гемолизин-продуцирующего штамма вибри- она Рпереносят в дрожжевой бульон, рН 7,6, приготовленный из очищенного дрожжевого экстракта (30 мг 7. аминного азота) с 0,37 глицерина. Культуру инкубируют 20-24 ч при,37 ОС со встряхиванием. С целью обеззараживания эа 2 ч до конца срока инкубации в культуру добавляют мертиолат (конечная концентрация 0,00017). Клетки отбрасывают центри 982347 2Изобретение относится к медицинской микробиологии.Известен способ получения гемолизина путем выращивания гемолизинпродуцирующего штамма в жидкой питатель 5ной среде с последующим отделениемжидкой Фазы, содержащей целевой продукт 1 11.Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта.Целью изобретения является повышение выхода гемолиэина.Цель достигается тем, что приосуществлении способа получения гемо 15лизина путем выращивания гемолиэинпродуцирующего штамма в жидкой питательной среде с последующим отделением жидкой Фазы, содержащей целевойпродукт, используют штамм ЧьЪгюЮая Р, а выращивание. ведут яасреде, содержащей экстракт дробейс 30 мг 7. аминного азота и 0,37.глицерина.Штамм Ч. Иа Рвьделен изречной воды и имеет следующие морфо"логические и Физиологические характеристики. Клети его в виде изогнутыхпалочек, с умереняо выраженным полиморфизмом, величинои 15-2,0 хх 03-0,4 мк. На пластинах 1,5-2 ьщ ЗОагаре Мартена (рН 7,6-7,8) через12-16 ч вибрионы штамма вырастают ввиде округлых нежных полупрозрачных Средав проходящем и слегка голубоватых вотраженном свете колоний. В бульоне З 5и пентонной воде НАГ-вибрион в процессе роста дают равномерное помутнение и образуют пленку.Штамм Ч. Иа Робладаетоксидазной активностью, Ферментирует глюкозу в среде Хью и Лейфсояа вазробных и анаэробных условиях,ферментируют маннит, сахароэу, маннозу,но не расщепляют арабинозу, лактозу,инозит. Обладает протеолитической,диастатической и лецитиназной активностями, образует индол и нвг:продуцирует сероводорода,декарбоксилируетлизин и орнитин, но не имеет дигидро-лазы аргинина. Характеризуется прото трофным типом питания на искусственных средах.Холерными сыворотками "0", Инаба,. Огава и Квибрионы этого штаммане агглютинируются, к холерным фагам С, Эль, Тор, ХДФ-З, 4,5 вибрионы не чувствительны и являются нели-.эогенными. При внутрикишечном эараРедактор О. Фипиппова Техред С.Ви уиова. Корректор О. Тигор Заказ 9206/2 Тираж 521 Подписное ВННИПН Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раущская наб д, 4/5Филиал НПП фПатент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 9.82347фугированием при 5000 об/мин, рН препарата гемолизина составляет 250- надосадочной жидкости устанавливают 640 усл, ед/мг сухого веса.7,4 и насыщают до 603. сухим сульфа- Для определения гемолитической актом аммония (рН 7,4). Через 18 ч .тивности необходимо иметь свежую (4 э) осадок собирают центрифугирова-кровь здорового кролика, которую вием ресуспендируют в 0,01 И фосфат" дважды отжвают физиологическим растном буфере, рН 7,4, с ЭДТА (0,001 И) вором с нейтральным значением рН и диалиэируют против этого же буфера путемцентрифугированияпри 3000 об/мин. до полного удаления следов сернокис- Осадок разводят 1:5 и из полученной лого аммония. Проверенный на гемоли О суспензии готовят разведение эритротическую активность колориметричес-щитов, под которой понимают такую ким способом препарат подвергают лно- взвесь, которая после разведения дис" фнлизации при естественном подогреве. тилированной водой в 20. раз дает Удельная активность выщеукаэанного экстракцию 0,25.