Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

,51, с 12 х 9 28) ) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИЙ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(46) 30.03.84. Бюл, У 12 (72) А.М.Голубев, О.В,Морозкин, П.П.Кулагин и М.А.Володин (71) Астраханский государственный медицинский институт им. Л.В.Луначарского(56) 1. ЬеЬпип Г.У., 1.еЬтап П, Ьеаа 1 яоепхуше 1 яо 11 гцщ бег а 1 Еа 11 ясЬеп РЬоярЬаСаяе аця МепясЬ 11 сЬег Р 1 аяеп йа цпЙ Еп 1 ы 1 сЬ 1 цщ е 1 пег ещрГ 1 пИ- сЬеп МесЬойе Гцг с 11 е Тцшогй 1 адпояй 1 К . - Иегп. ПгясЬ . Сег, А 1 ш Мес).80 Копег., У 1 еяЪас 1 еп, 1974, 1658- 1661.(54) (57) СПОСОБ ВСЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ШЕПОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатомаммония, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения сохранения активности фермента экстрагирование осуществляют 3 М растворомхлористого калия при соотношении1:(3-4), для фракционирования используют 1,0-1,57-ный раствор хлористого цетилпиридиния в 4-5-кратномизбытке к обрабатываемому растворуи сульфат аммония в количестве 30652 от степени насыщения.Изобретение относится к биохимиии медицине и касается способов вьщеления ферментов, в частности щелочной пллцентарной фосфатазы.Известнс, что некоторые злокачественные опухоли обладают способностью к неосинтезу щелочной фосфатазы.Значение, этого фермента весьма велико для клинических наблюдений.Известен способ выделения термостабильной плацентарной фосфатазы,предусматривающиЙ экстрагированиефермента из сырья 307-ным бутанолом,фракционное осаждение ацетоном,кратковременную термообработку (обыч но при 65 С), фракционирование белков сульфатом аммония (45-627), хроматографию Ферментсодержащего раствора на диэтиламиноэтилсефадексеА, гельфильтрацию на сефадексеСи кристаллизацию 1 1 3.Однако данный способ обеспечиваетсохранение активности фермента) 52,37 (органические растворителивызывают денатурацию белка и увеличивают потери активности). 20 Цель изобретения - повышение сохранения активности фермента.Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирова 35 ние белков из раствора сульфатом аммония, экстрагирование осуществляют ЗМ раствором КС 1 при соотношении 1:(3-4), для фракционирования используют 1,0-1,57-ный раствор хлористого цетилпиридиния в 4-5-кратном избытке к обрабатываемому раствору и сульфат аммония в количестве 30-657 от степени насыщения.Способ обеспечивает сохранение активности фермента до 727П р и м е р 1. Отмытую от крови человеческую плаценту (100,0 г) гомогенизируют при 8000 об/мин 5 мин.Добавляют в соотношении 1:3 раствор50 3 М КС 1 и перемешивают на магнитноймешалке при 4 С в течение 12 ч. Растовор центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин, Осадок отбрасывают, надосадочную жидкость диализируют против дистиллированной воды в 2 смены по55 60 мин и против 0,1 н.раствора НаС 1 также в 2 смены по 60 мин. Экстракт прогревают прц 65 С 10 мин К объемуо ИСКДИОГО .) КС ТРа 1 Т)1 11 )б 1 ИЛ 5110 Т Ца магцитцой мешалк 1, -цыц раствор хлор и с т О Г о ц е т 51 л и и ) ц)1 ц ц 11 51 В с о о т ц 01 Н е ни и 1:4 и помещают ц .;:1 од (-4 С) цао60 миц, Экстрах) цецтрифугцруют при 6000 об/миц 30 м)1 ц, Надосадочную жидкость отбрасывак)т, а осадок растворяют в 3,57.-цом растворе 1111 С 1. Диализируют против дистиллированной воды 60 мин.На следующем этапе ц)ледени)1 экстракт насьпцают серцокислым аммонием (307.). Цецтрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочцую жилкость насыщают 657-ным серцокислым аммонием, Проводят диализ. Цецтрифугируют 6000 об/мин 30 мин, цадосадочцую жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в мини - мальном объеме трис-буфера (рН 8,6).После этих этапов пробы ставят в препаративцый электрофорез ца 2 ч в полиакриламидцом геле, Окрашивают на щелочцу)о Фосфатазу: субстрат нафтил ЛЯ - Ол - Фосфат, краситель прочный синий ВВ-буфер вероцац-мединаловый рН 8,6, Под визуальным контролем вырс эают Фракции термостабильной плацентарной щелочной Фосфатазы 1 и 1.1, т,е. получают в раздельном виде 1)ракции изоэцэимов термостабильцой плацентарной щелочной фосфатазы 1 и 11 в чистом виде. Суммарное количество белка по Лоури 48 мг.П р и м е р 2. Отмытую от крови плаценту (100,0) гомогенизируют 7000 об/мин 5 мин. Добавляют 3 М КС 1 в соотношении 1:4 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 14 ч. Раствор центрифугируют 5000 об/мин 25 миц. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость диализируют в 2 смены против дистиллированной воды по 90 мин и в 2 смены по 90 мин против 1 н.раствора 1)1 аС 1, Экстракт нагревают при 68 С 12 мин. Добавляют 1,57-ный цетилпиридиний хлористый в соотношении 1:5 на магнитной мешалке, помещают ца холод (-4 С) на 90 мин. Центрифугируют со скоростью 5000 об/мин 20 мин. Недостаточную жидкость отбрасывают, осадок растворят в 47,-ном растворе МаС 1. Диализируют против дистиллированной воды 90 миц.На следующем этапе цасыщак: сернокислым аммоцием в интервале 35- 607 Центрифугирук)т со ск 1)рст)ю 5000 об/миц 20 мцц. Осадок );. тц 1)рн -1082811 Таблица 1 Результаты вьделения термостабильной щелочной плацентарной фосфатазы Этап обработки Вьделение фермента мг/мл мг (щ.ф.) мг (щ,ф.) мг щ.ф. иэ 1 1 общ.белка.7,мг Начальный Бутанольнаяэкстракция 0,485 12970 12620 1,43 90,4 0,007 КС 1-экстракция(предлагаемый способ) 12970 28600 2,2 811,2 0,062 2,8 Конечный выход Известный способ 8,2 47,8.5,83 47,3 5,78 Предлагаемыйспособ 4,8 565,9 118,2 567,8 4,77 99,5 П р и м е ч а н и е. Расчет производился по количеству щелочной фосфатазы(щ.ф.) в растворе бутанолового экстракта с учетомпотерь в процессе выделения (прототип) и количествувыхода целевого продукта. Таблица 2 Вьделение плацентарной термостабильной щелочнойфосфатазы Выделение ферментаФ Этап обработки мп Ед мг Вд/мг белка Выход,Е Экстракт плаценты после обработки 3 М хло 100,0 400 14756 68000 2,17 ристым калием 1062 4,5 23,77 72,0 5,0 Конечный выход ют в минимальном объеме трис-буфера (рН 8,6). Пробы ставят в препаративный электрофореэ в полиакриламидном геле.В результате осуществления пред 5 лагаемого способа получены изоэнзимы термостабильной щелочной фосфатазы 1 и 11 в чистом виде. Суммарное количество белка по Лоури 40 мг. Полученные фракции могут быть использованы для получения моноспецифическихсывороток для использования н медицине . Результаты выделения фермента приведены в табл. 1 и 2.1082811 Составитель О.СкородумоваРедактор Л.Пчелинская Техред Ж.Кастелевич Корректор Л,Шеньо Заказ 4060 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/511 илиял ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Предлагаемым способом достигает ся сокращение времени исследования на 7-8 сут, увеличение выхода целевого продукта в чистом виде из состава тканевых мембран в 5-6 раз, а 5 также при осуществлении предлагаемого способа требуется меньшее количество реактивов, исключается применение высокоскоростных рефрижераторных центрифуг и дорогостоящей аппаратуры. Таким образом, способ обеспечивает сохранение активности фермента при выделении до 727,