Способ получения неорганической пирофосфатазы из еsнеriснiа coli

. 1 дБКЫ ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ нова Сопя 1 Ыц 1 хчеабазе о 1 ЕясЬеаг те 3.М апйоГ СЬе епкутпеВо 1, СЬетп.345/1970. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) Авторское свидетельство СССРУ 1158933, 1984,вопд В.С.К. е 1 аЗ.пог 8 ап 11 с ругорЬоярЬгсИа соИ, Мо 1 есйрЬуятсо 1 ргорег 13.еяапй Ня яиЪппИя 1,7, 245, 9 17, 4335-4 2 И 9/14// (С 12 И 92 Н 1:19 )(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОЙПИРОФОСФАТАВН ИЗ ЕБСНЕВ 1 СН 1 А С 01 1(57) Изобретение позволяет упроститьпроцесс получения неорганическойпирофосфатазы из ЕясЬегсЫ.а соИ .Разрушение клеток осуществляют дезинтеграцией. Термическую обработкуведут в проточном теплообменнике при83-88 С в течение 1-2 мин, Фракционирование сульфатом аммония и хроматография на 1,6-диаминогексилагарозеобеспечивают получение пирофосфатазы с удельной активностью 1250 Е/мгбелка при выходе 170 мг/кг биомассы.2 табл,Изобретение относится к ферментной промьппленности, а именно к способу получения неорганической пирофосфатазы из ЕясЬегс 1 п.а со 1.Цель изобретения - упрощение процесса.Способ предусматривает проведение термической обработки при температуре 53-88 С, что по сравнению с прототипом позволяет более полно отделить посторонние белки на этой стадии очистки, Длительность термической обработки в предлагаемом способе составляет 1-2 мин, 5Зависимость продолжительности обработки, выхода и активности фермента представлена в табл. 1.Т а б л и ц а 1 20 Время термической обработки, мин Выход фермента,мг/кг биомассы Удельнаяактивность,Е/мгбелка 25 230 1030 1220 195 1,5 170,250 165 1270 Согласно этой таблице оптимальное время термообработки составляет 1,5- 2 мин.Увеличение эффективности терми ческой обработки происходит за счет того, что неорганическая пирофосфатаза лучше выдерживает термическую 40 обработку в течение короткого времени при повышенной по сравнению с прототипом температуре чем посторонние белки, Термическую обработку можно проводить согласно изобретению при 45 83-88 С. Оптимальной является температура 83-85 С, При меньших температурах остается больше посторонних белков, при больших - происходит значительная инактивация неорганической пирофосфатазы,Хроматографирование на 1,6-диаминогексилагарозе позволяет обеспечить эффективную очистку неорганической пирофосфатазы благодаря тому, что сродство неорганической пирофосфатазы ЕясЬегсИа со 1 к 1,6-диаминогексилагарозе велико по сравнению с другими белками. Вследствие этогоТаблица 2 Выход Уд,акт.после ТемУд.акт.целевогопродукта, Е/мг емя,целевого ператураС н термообработки, Е/мг продукта, Е 10,8 1150 13,3 1270 13,1 1280 7,6 1270 11,8 1330 80 2 62 83 2 88 2 93 2 80 10 45 П р и м е р, Суспензию 2 кг биомассы ЕясЬег 1 с 1 п.а со.1 (нтамм МРЕ) в 6 л 0,05 М буфера трис-НС 1(рН 7,2), содержащего 10 мМ МОСХ они отделяются от 1,6-диаминогексилагарозы при концентрации ИаС 1, не достаточной для элюции неорганической пирофосфатазы. Последняя отделяется при концентрации ИаС 1 около 0,5 М, что редко встречается в ирактиже хроматографирования белков на этом сорбенте.То, что неорганическая пирофосфатаза ЕясЬегс 1 п.а со 11 лучше выдерживает нагревание при повышенной температуре в течение короткого времени чем посторонние белки и имеет высокое сродство к 1,6-диаминогексилагарозе, ранее не было известно и немогло быть предсказано на основании имевшихся данных.Увеличение эффективности термической обработки в сочетании с высокой эффективностью хроматографирования на 1,6-диаминогексилагарозе позволяет исключить стадии центрифугирования, обработки стрептомицинсульфатом и кристаллизации и проводить хроматографирование в одну стадию вместо двух.В табл.2 приведены выход и удельная активность неорганической пирофосфатазы после термической обработки при разных температурах, Нижняя строка содержит данные, полученные при проведении термической обработки согласно известному способу.1307850 нии процесса выделения неорганической пирофосфатазы-, за счет сокращения числа стадий и обеспечения технологичности при крупномасштабномпроизводстве, что дает возможностьобеспечить потребность в неорганической пирофосфатазе для развитияпрогрессчвного иммуноферментногоанализа в СССР. Формула изобретения Составитель И,Привалова Техред М.Ходанич Корректор Л,Патай Редактор Л.Павлова Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Заказ 739 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 обрабатывают на гомогенизаторе СКТБ "Дезинтегратор" или 15 М ("ОаиИл Согр", СПА) в режиме 300-500 атм.Полученную суспензию последователь 5 но пропускают со скоростью 3,6 л/ч через два теплообменника, омываемые водой при температуре 85 и 10 С соответственно и центрифугируют, К надосадочной жидкости прибавляют сульфат аммония до насыщения 0,55, центрифугируют, осадок отбрасывают, к надосадочной жидкости прибавляют сульфат аммония до насыщения 0,75, центрифугируют. Осадок растворяют в 200 мл воды, диализуют против воды и наносят на колонку диаметром 4 см и длиной 50 см с 1,6-диаминогексилагарозой. Колонку промывают буфером 0,05 М трис-НСХ, содержащим 1 мМ МЯСА с возрастающей концентрацией ИаС 1 (от 0 до 0,7 М) до десорбции неорганической пирофосфатазы, Выход неорганической пирофосфатазы с удельной активностью 1250 Е/мг составля ет 170 мг/кг биомассы.Технико-экономическая эффективность способа заключается в упрощеСпособ получения неорганической пирофосфатазы из ЕзсЬегсМа со 1 х, предусматривающий разрушение исходных клеток, термическую обработку, . фракционирование сульфатом аммония и хроматографирование с использованием ионообменного сорбента, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, температуру термической обработки устанавливают равной 83-88 С и продолжительность воздействия 1-2 мин, а при хроматографировании в качестве ионообменного сорбента используют 1,6-диаминогексилагарозу.